HPVinfo.ru - папиллома и вирус папилломы человека

Статьи на тему ВПЧ

ОБОСНОВАННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ
РАКА РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ

 

Данные, представленные выше, свидетельствуют о том, что опухолевая клетка обладает многими системами для восприятия пролиферативных сигналов. В том случае, если одна из них блокируется приемом лекарственных препаратов, например, назначением антиэстрогенов при терапии эстроген-зависимых опухолей, то немедленно включается другая. При таких способностях опухолей к выживанию даже трудно вычленить, какой именно стимул является ключевым: блокада одного из них приводит к моментальному включению других сигнальных каскадов, с возможностью использовать компоненты одного пути в пользу другого. Уникальная адаптационная способность опухолевых клеток диктует необходимость разработки новых подходов к этой проблеме.

На многочисленных онкологических международных форумах в последние годы намечены основные тенденции в борьбе с этим видом патологий. Коротко их можно обозначить в виде следующих тезисов:

  1. В последние годы стала очевидной необходимость комплексного (или, как принято называть в иностранной литературе, мультифокального) подхода к терапии опухолей. Блокаду пролиферативной активности клеток-мишеней целесообразно проводить на уровне мембран, цитоплазмы, ядра. При этом в качестве внеклеточных способов коррекции рассматриваются, в числе прочих, блокада лиганд-рецепторных взаимодействий - ростовых факторов, гормональных, а также управление экспрессией "нужных" форм цитохрома Р-450 через взаимодействие с Ah-рецептором. Цитоплазматическими мишенями могут быть киназы, как рецепторные, так и свободные, а также множество других участников каскадной передачи от мембраны к ядру. Внутриядерная коррекция подразумевает блокаду активаторов транскрипции, модуляцию активности ядерных рецепторов, защиту от изменений нуклеотидов (например, метилирование) ДНК. В настоящее время на рынке имеется множество блокаторов пролиферации опухолевых клеток с самой различной направленностью. Клиницистам предстоит большая работа по выработке оптимальных доз и комбинаций лекарственных препаратов в лечении опухолевых заболеваний, которая, будем надеяться, закончится успехом.
  2. Усилить акцент на разработке новых прогностических маркеров, позволяющих регистрировать начинающиеся в организме процессы малигнизации. Специалистам хорошо известно, что чем раньше поставлен диагноз, тем выше эффективность проводимых лечебных мероприятий. Необходимо широкое внедрение скрининговых программ, позволяющих выявлять начальные стадии заболевания и существенно снижать смертность.
  3. Сконцентрировать усилия на профилактике онкологических заболеваний. Эпидемиологические исследования в области онкологии убедительно свидетельствуют о том, что рак во многом является результатом образа жизни.

В последнее время потенциальным источником противоопухолевой и антиопухолевой защиты рассматривается диета. Эпидемиологические исследования показывают, что в странах, где традиционно потребляется большое количество овощей, риск возникновения рака гораздо меньше. Многочисленные исследования последних лет посвящены фитонутриентам - веществам растительного происхождения: терапевтические концентрации некоторых из них оказывают поразительный эффект, связанный с избирательным ингибированием роста опухолевых клеток, индукцией их апоптоза.

В литературе широко представлены и подробно изучены молекулярные механизмы блокады пролиферативной активности фитонутриентов, которые проявляют свое действие на уровне мембран, цитоплазмы и ядра клетокмишеней, модулируя сигнальные каскады как на белковом, так и транскрипционном уровне. Механизмы избирательной активности смеси фитонутриентов вмешиваются в гормонозависимую (эстроген-и андроген-зависимую) пролиферацию, блокаду сигнальных путей, индуцируемых ростовыми факторами, осуществляют нормализацию защиты естественных анти-оксидантных систем клетки, метаболическую коррекцию цитохромной системы (цитохромов Р-450) оксигенации эстрогенов и канцерогенов, вмешиваются в клеточный цикл (78, 84).

Роль диеты в индукции противоопухолевой защиты вызывает небывалый интерес и в настоящее время интенсивно изучается. Этому вопросу посвящены многочисленные эпидемиологические исследования, на основе которых Всемирная организация здравоохранения констатирует ряд показательных выводов: диета является определяющим фактором в развитии и профилактике опухолей. Масштабные эпидемиологические исследования показали, что традиционные привычки в питании вносят значительный вклад в показатели смертности от опухолей в различных странах. Приведенная на Рис. 20 диаграмма отражает общую тенденцию по всем опухолевым заболеваниям, с тем лишь отличием, что доля смертей на определенное количество населения (обычно на 100 тысяч) варьирует в разных странах. Однако общая тенденция сохраняется, и в странах, где традиционным считается употребление рыбы, сырых овощей и фруктов (Юго-Восточная Азия, страны Средиземноморья), уровни заболеваемости гораздо ниже по сравнению с таковыми в Европе и Америке. Современные технологии приготовления пищи, стремление к увеличению ее сроков годности, добавление консервантов и искусственных красителей, различных стабилизаторов и усилителей вкуса вносят отрицательное влияние на здоровье человека. Изучение заболеваемости эмигрантов также подтверждает эти выводы: смена традиционной диеты влечет развитие тех же заболеваний, которыми страдает местное население. Эти показатели отодвигают на второй план значение генетической предрасположенности к развитию опухолей и ставят диету в один ряд с другими влиятельными факторами - окружающая среда, курение, иные привычки, относящиеся к стилю жизни. Можно сказать, что рак, среди прочего, - это заболевание стиля жизни. По крайней мере, статистика эти выводы не опровергает.

Все эти показатели стимулируют изучение биологических особенностей основных компонентов пищи, составляющих основу традиций питания той или иной страны.

 

Катехины зеленого чая. Эпигаллокатехин-3-галлат

 

Второй после воды, чай является одним из наиболее популярных напитков, и его частое употребление напрямую связывают с поддержанием нормальной работы отдельных органов и систем - сердечно-сосудистой, нервной, мочевыделительной, а также улучшением общего эмоционального состояния организма. Экстракт зеленых листьев различных сортов кустарника Camellia sinensis, именуемое чайным деревом, позволяет получить множество видов чая, отличающихся способом приготовления, содержанием катехинов, кофеинов, других полифенольных компонентов.

Имеются поразительные данные эпидемиологических исследований о противоопухолевых эффектах отдельных чайных компонентов. Так, например, по данным итальянских исследователей, ежедневное употребление зеленого чая способствует защите от рака ротовой полости, гортани, глотки. По другим данным, полученным из Шанхая, частое употребление чая ассоциируется со снижением заболеваемости раком пищевода, даже среди курящих и употребляющих алкоголь (102). Защитный эффект зеленого чая подтвержден в Турции, Швеции, Японии: ежедневное употребление этого напитка местными жителями способствует защите от рака желудка. Употребление японскими женщинами более 10 чашек чая в день (около 2 литров) снижает риск возникновения и метастазирования рака молочной железы. При этом аналогичных данных не получено при употреблении черного чая. Таким образом, зеленый чай обладает сильнейшим превентивным эффектом на многие солидные опухоли, и изучение активностей чайных компонентов постепенно становится в один ряд с масштабными исследованиями, посвященными изучению механизмов действия традиционных противоопухолевых средств.

Наибольший интерес в последнее время вызывают полифенолы зеленого чая, в основном, катехины, обладающие целым спектром защитных эффектов на органы и ткани. Водный экстракт зеленого чая содержит эпигаллокатехин-3-галлат (epigallocatechin-3-gallate, EGCG), эпигаллокатехин (epigallocatechin, EGC), эпикатехин-3-галлат (epicatechin-gallate, ECG) и эпикатехин (epicatechin, ЕС) (Рис.21). Все они обладают сильнейшей антиоксидантной активностью, по своей силе сравнимой с таковой у токоферола-альфа (витамина Е). Важнейшим дополнением является мощный антипролиферативный потенциал: клетками-мишенями являются все клетки, где наблюдается стимуляция экспрессии тех компонентов, от которых зависит рост и количество данного типа клеток. Можно сказать, что чайные катехины обладают избирательной активностью по отношению к пролиферирующим, активно делящимся клеткам. Поэтому уровень избирательной активности в отношении гиперпластических процессов, вне зависимости от стимулов, у чайных катехинов чрезвычайно широк.

Сложным процессам ингибирования опухолевого роста катехинами есть многочисленные доказательства, как in vitro, так и in vivo. Общим механизмом антиопухолевой активности катехинов считался антиоксидантный эффект. Однако, благодаря интенсивным изучениям этих веществ, стало известно, что катехины обладают комплексным воздействием на многочисленные пролиферативные пути в опухолевых клетках, среди которых наибольший вклад в стимуляцию роста, развития и метастазирования опухолей вносят рецептор-опосредованная стимуляция ростовыми факторами, как следствие этого - активация цитоплазматических и рецепторных тирозин-киназ, активация транскрипционных факторов, развитие провоспалительной реакции, стимуляция неоангиогенеза. Модуляция вышеуказанных процессов катехинами характеризует их с позиций мощных противовоспалительных, анти-пролиферативных, анти-ангиогенных природных компонентов.

Одним из интереснейших представителей чайных катехинов является эпигаллокатехин-3-галлат (epigallocatechin-3-gallate, EGCG). Максимально возможное употребление чая в течение дня приводит к увеличению концентрации EGCG до 326 нг/мл в плазме. Время полувыведения EGCG составляет 5-5,5 часов, что намного выше, чем у других катехинов. Абсолютно нетоксичен; механизмам его противоопухолевой активности посвящено множество исследований.

 

Модуляция внутриклеточных сигнальных каскадов

 

В основе антипролиферативной активности EGCG лежит, в частности, его способность блокировать развитие воспалительных реакций. Цитокины IL-8, TNF-a, активируемый ими NF-kB являются основными факторами, вовлеченными в развитие воспаления. Оно имеет место при всех заболеваниях с пролиферативным и (или) аутоиммунным компонентом, среди которых наиболее трудноизлечимыми являются атеросклероз, псориаз, полиартриты, эндометриоз, мастопатии, а также при доброкачественных и злокачественных новообразованиях. Показано, что EGCG ингибирует TNF-опосредованную активацию NF-kB (49, 96). Кроме того, NF-kB ингибируется также через блокаду другого пути, индуцируемого IL-1 (99). Инактивация обоих сигнальных путей достигается благодаря уникальной возможности EGCG вмешиваться на любом уровне провоспалительных сигнальных каскадов. Показано, что в клетках-мишенях IL-1 и TNF-aEGCG является ингибитором IRAK-киназы, вовлеченной в IL-1-индуцированный сигнальный каскад, блокатором фосфорилирования субъединицы рб5 NF-kB. В отсутствие NF-kB нарушается экспрессия IL-8 - основного хемоаттрактанта и стимулятора миграции моноядерных лейкоцитов (лимфоцитов) и нейтрофилов в зону воспаления. Кроме того, IL-8 также стимулирует экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

 

Ингибирование металлопротеиназ

 

Матриксные металлопротеиназы (ММР) очень активно экспрессируются в опухолевых клетках, а также в клетках эндотелия (50). Они вовлечены в деградацию клеточного матрикса и миграцию эндотелиальных клеток. Основная их функция в опухолевых клетках - разрушение базальной мембраны и облегчение клеточной инвазии. ММР активируются параллельно на про-воспалительном фоне, совместно с IL-1 и TNF-a. В экспериментах установлено, что инвазивный потенциал опухолевых клеток ингибируется блокаторами ММР - как синтетическими, так и тканевыми (59). Эти препараты сейчас активно используются в клинических испытаниях в качестве противоопухолевых средств. Однако они обладают нежелательными побочными эффектами: их употребление сопровождается, в частности, мышечной и костной болью. Недавно было показано, что EGCG эффективно ингибирует активность некоторых представителей металлопротеиназ, - ММР-2 и ММР-9 (Gabrisa et al., 2001). Интересно, что подобная активность достигается при такой концентрации EGCG, которая наблюдается у людей, употребляющих даже небольшое количество чашек зеленого чая ежедневно. При этом, согласно экспериментам in vivo, степень опухолевой инвазии и размер опухоли уменьшались примерно на 50% (34).

Поскольку EGCG образует комплексы с металлами, ингибирование ММР может быть объяснено его способностью хелатировать цинк, являющийся необходимым для проявления ферментативной активности металлопротеиназ (64). Кроме того, в других исследованиях показано, что добавление цинка в присутствии EGCG абсолютно подавляло активность ММР, фактически усиливая это ингибирование (34) (Рис. 22).

Инактивация ММР может быть использована и при лечении заболеваний неопухолевого генеза, но которые также сопровождаются не менее сильной пролиферативной реакцией. Классическим примером является артрит. Воспаление, индуцируемое IL-ip, сопровождается усиленной экспрессией и активностью ММР: всё направлено на разрушение и потерю хрящевой ткани, что ассоциируется с хроническим воспалением при данном заболевании. Показано, что EGCG не только абсолютно нетоксичен для хрящевой ткани, он ингибирует экспрессию воспалительных медиаторов в суставах при артрите. EGCG блокирует IL-ipиндуцируемую активность матриксных протеиназ ММР-1 и ММР-13 в хрящевой ткани, активацию NF-kB и АР-1, обеспечивая тем самым стабильную молекулярную основу для анти-воспалительных процессов и заживления (2).

 

 

Ингибирование урокиназы

 

Урокиназа - это гидролаза, также вовлеченная в инвазию и метастатический потенциал опухолевых клеток (46). Как и металлопротеиназы, урокиназа усиливает деградацию внеклеточного матрикса. В экспериментах регистрировалась повышенная экспрессия урокиназы в опухолевых клетках молочной железы, яичников, простаты, где отмечена ее ключевая роль в развитии метастазирующего рака (36). Ингибирование активности плазминогенактиватора урокиназного типа (иРА) значительно редуцировало объем и размер опухолевой массы, а в некоторых случаях наступала полная ремиссия опухолей in vivo (47). EGCG является непосредственным блокатором урокиназы, изменяя ее ферментную активность и, как следствие, способность к деградации внеклеточного матрикса. Компьютерное моделирование комплекса EGCG с урокиназой позволило идентифицировать аминокислотные остатки, которые ответственны за ее ферментативную активность: комплексообразование EGCG* с каталитической триадой - гистидином 57, серином 195 и аргинином 35 в молекуле урокиназы полностью нивелирует ее активность: фермент перестает распознавать субстрат (48). Однако uPA-ингибирующая активность EGCG наблюдается только в концентрациях, намного превышающих таковую в крови при обычном употреблении чая (14).

Интересные данные получены на клетках фибросаркомы человека НТ 1080. EGCG индуцировал не только супрессию промоторной активности иРА, но и дестабилизацию мРНК иРА. Отмечено также ингибирование фосфорилирования митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК) - Erk1/2 и р38 МАРК (56). Благодаря данным, полученным авторами, можно сделать вывод, что EGCG регулирует экспрессию uPA, как минимум, за счет двух механизмов: путем подавления промоторнои активности и нарушения структурной стабильности мРНК uPA.

 

 

 

 

 

 

 

EGCG и циклооксигеназа-2

 

В опухолевых клетках наблюдается усиленная экспрессия циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - фермента, играющего ключевую роль в синтезе простагландинов (PGE2). Простагландины, в свою очередь, стимулируют экспрессию VEGF - ростового фактора, вовлеченного в специфические митогенные и хемотаксические эффекты в клетках эндотелия сосудов. Снижение рецидива опухолей наблюдается при приеме нестероидных противовоспалительных препаратов - ингибиторов СОХ-2. Вначале этот эффект был отмечен при раке прямой кишки, впоследствии - на всех солидных опухолях, где регистрируется повышенная активность СОХ-2. После приема EGCG наблюдалось снижение уровня PGE2, что характеризует EGCG как специфический СОХ-2 - ингибитор (6). Эти результаты дополняют исследования Hong и соавторов, которыми показано, что чайные полифенолы вмешиваются в СОХ-2-зависимый метаболизм арахидоновой кислоты, что ассоциировалось со снижением инцидентов развития рака прямой кишки (43). В то же время доказано отсутствие какого-либо угнетающего эффекта на промоторную область гена СОХ-2 в ряде опухолевых линий карциномы прямой кишки человека (69). Интересно, что СОХ-2-стимулирующая активность под влиянием EGCG обнаружена в макрофагах (73). Очевидно, что проявление разных эффектов EGCG на экспрессию СОХ-2 зависит от дозы катехина, типа клеток-мишеней, способов введения, каких-то других дополнительных факторов.

 

 

 

Регуляция клеточного цикла

 

Клеточный цикл млекопитающих, способы управления его регуляцией в последнее время довольно интенсивно изучаются. Особенно, если речь идет о методах и подходах к лечению опухолевых заболеваний: анормальное клеточное деление - основная характеристика активно делящихся опухолевых клеток и восстановление (угнетение) скорости их деления - одна из важных составляющих противоопухолевой терапии. В процесс клеточного деления вовлечено множество комплексов, факторов транскрипции, адапторных белков, онкогенов.

Ключевую роль в процессе деления клеток выполняют циклины - "положительные" регуляторы клеточного цикла, а также циклин-зависимые киназы (CDK) - целое семейство киназ с антиапоптотическими свойствами. Пролиферативные процессы сопровождаются комплексообразованием циклинов с CDK в зависимости от стадий клеточного цикла. Так, например, ранняя Gl-фаза регулируется "циклин D - CDK4/6" комплексом, в S-фазу вовлечены "циклин Е - CDK2" и "циклин А - CDK2", остальные фазы управляются "циклин В - CDK1/2" комплексами (100).

Опухолевые клетки нуждаются в гиперэкспрессии указанных компонентов для активации синтеза ДНК необходимых генов (S-фаза), а также митоза (М-фаза клеточного цикла). Поэтому в опухолях циклины и циклин-зависимые киназы обладают повышенной экспрессией, в то время как CDK-ингибиторы, такие как р21, р27, р1б, р15 практически отсутствуют.

Показано, что EGCG ингибирует CDK2 и CDK4, и при этом усиливаетэкспрессию p21 waf VCIP1 и р27к,Р1 (60), в том числе при довольно низких концентрациях (61). При этом отмечено, что при концентрации, которая устанавливается в крови человека после выпитой чашки чая (0,1 цд/ml EGCG), наблюдается эффект довольно сильного синергизма с традиционными противоопухолевыми препаратами.

 

Блокада неоангиогенеза

 

Опухолевый неоангиогенез характеризуется усиленной экспрессией VEGF и его рецепторов, что способствует улучшению трофики новообразований. Появление новых сосудов в опухоли - классический пример патологического неоангиогенеза. Существенный вклад в противоопухолевую стратегию вносит блокада ангиогенеза. Блокирование VEGF или его рецепторов (VEGFВ, VEGF-C и VEGF-D) почти полностью прекращает пролиферативную активность в эндотелии сосудов. Это означает, что антиангиогенные факторы вносят существенную коррекцию в пролиферативную реакцию. Показано, что EGCG значительно снижает уровень VEGF и плотность его рецепторов in vitro (91). Механизм ингибирования VEGF и его рецепторов может быть объяснен следующими фактами. Блокада указанных факторов происходит, в частности, на уровне активаторов транскрипции. В промоторной области VEGF имеются несколько сайтов связывания с фактором транскрипции АР-1, который является мишенью для EGCG. Препятствие для взаимодействия с ДНК является определяющим в EGCG-индуцированной блокаде транскрипции VEGF и его рецепторов.

В экспериментах in vivo также установлено блокирующее влияние EGCG на развитие сосудистой сети. Сравнительная антиангиогенная активность EGCG и ЕС исследовалась на животных моделях (51). Мышам подкожно вводились опухолевые клетки НТ29 (карцинома прямой кишки). В данном эксперименте демонстрировалась четкая зависимость концентрации и времени воздействия EGCG на ингибирование роста сосудов и индукцию апоптоза в опухолевых клетках (Рис. 23). Животные получали ежедневную инъекцию EGCG в количестве 1,5 мг в день интраперитонально (ЕС использовался в качестве отрицательного контроля).

По сравнению с контролем, наблюдалось 30%-ное ингибирование плотности сосудистой сети, 58%-ное замедление опухолевого роста, замедление скорости опухолевой пролиферации на 27%, торможение метастазирования. Аналогичные данные с эффектом EGCG на ангиогенез-зависимую дифференцировку эпителиальных клеток получены Singh и соавт. (87), (Рис. 24).

EGCG ингибирует активность эпидермального фактора роста и индуцирует апоптоз эндотелиальных клеток, что поддерживает гипотезу, высказанную в работе Shaahen с соавт., о том, что VEFG является фактором выживания опухолевого эндотелия (86). Блокирование VEGF на транскрипционном и белковом уровне ведет к апоптозу эндотелиальных клеток внутри опухолей, что не только ингибирует неоангиогенез, но и коммитирует сами опухолевые клетки к апоптозу (Рис. 25).

На другой модельной системе (человеческая не-Ходжкинская лимфома) на животных показано, что включение EGCG в ежедневную диету также сопровождалось апоптозом эндотелиальных клеток, блокированием ангиогенеза с последующим вовлечением в апоптоз самих опухолевых клеток (7).

Еще один транскрипционный фактор, Ets-1, вовлечен в регуляцию неоангиогенеза. Он обладает совместным влиянием на экспрессию матриксных металлопротеиназ и VEGF, поскольку также имеет сайты связывания в промоторных регионах указанных генов (41). Влияет ли EGCG и на этот фактор транскрипции - пока неизвестно. Однако этот факт сам по себе интересен и еще раз доказывает наличие определенной сочетанной регуляции в опухолях, направленной на реализацию программы выживания опухолевых клеток любым способом. Этим, в частности, можно объяснить феномен "ускользания" опухолей от монотерапии. Следовательно, наиболее предпочтительным выбором при лечении опухолей является комплексный подход, сочетающий влияние на все звенья опухолевой программы выживания, а не на конкретный сигнальный путь.

He-опухолевый неоангиогенез наблюдается, в частности, при псориазе. При этом заболевании также отмечена усиленная экспрессия VEGF и его рецепторов, что способствует улучшению трофики псориатической бляшки, дальнейшему ее увеличению и развитию локального воспаления. Блокирование VEGF или его рецепторов VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D (например, моноклональными антителами) тормозит развитие воспаления, прекращает локальную пролиферативную активность. Это означает, что антиангиогенные факторы вносят существенную коррекцию в воспалительную реакцию. EGCG является антиангиогенным фактором, ингибирующим как белковую активность VEGF и рецепторов, так и уровень их транскрипции. Вовлечение ангиогенеза в развитие псориаза доказано с открытием генного полиморфизма по отношению к VEGF. У пациентов с серьезной формой псориаза отмечено нарушение системной регуляции VEGF из-за полиморфных вариантов рецепторов к VEGF в активированных кератиноцитах кожи (30, 104). Блокирование ангиогенеза катехинами приводило к стойкой и длительной ремиссии, сопровождаемой очевидными улучшениями состояния кожи, а также общим эмоциональным статусом пациентов.

Еще одно доказательство важности анти-ангиогенной терапии при псориазе получено при исследовании ретиноидов. Жирорастворимые витамины традиционно используются для лечения псориаза. Недавно выяснен механизм их анти-псориатического действия. Ретиноиды становятся биологически активными в результате активации ими одного из двух путей: взаимодействия со своими ядерными рецепторами (рецепторами ретиноевой кислоты), либо взаимодействуя с ядерным фактором транскрипции АР-1. Интересно, что в промоторной области гена VEGF имеются четыре АР-1-связывающих сайта; взаимодействие ретиноидов с АР-1 блокирует экспрессию VEGF, т.е. ретиноиды обладают анти-АР-1 и, следовательно, анти-VEGF-aKтивностью.

 

Фотозащитный эффект EGCG

 

При определенных уровнях воздействия ультрафиолет становится сильным митогеном, что повышает риск развития рака кожи. Было показано, что употребление зеленого чая, либо его поверхностная аппликация на кожу оказывает защитный противоопухолевый эффект, предотвращает UV-индуцированное воспаление, иммуносупрессию, оксидативныи стресс в кератиноцитах. Совместное применение UV-облучения и EGCG при псориазе обеспечивает, с одной стороны, индукцию излишней пролиферации, сопровождающей заживление под влиянием облучения, а с другой - снимает излишнюю воспалительную реакцию под влиянием EGCG. Двойной механизм EGCG на выживание кератиноцитов связан, с одной стороны, со стимуляцией фосфорилирования Akt и Erk - киназ, препятствующих UV-индуцированному апоптозу, а с другой - смещению баланса Bax/Bcl в сторону увеличения Bel. Это нормализует время жизни кератиноцитов (с 9 у больных псориазом до 27 дней в норме), способствует их дифференцировке (21).

Иммуномодулирующий аспект также вносит немаловажный вклад в дерматологический контроль пролиферативной активности. Сбой в системе ТМ/ТТгё-лимфоцитов, дисбаланс про-и антивоспалительных цитокинов способствуют, как и в любом другом органе, смещению иммунологических ответов с соответствующими последствиями. Как правило, воспаление и аутоиммунные реакции сопровождаются и развиваются на фоне превышения активности Thl-подтипа лимфоцитов, развитие опухолей характеризуется снижением Thl-ответа, аллергий - усилением Th2. При сильном ультрафиолетовом облучении наблюдается иммуносупрессия, как системная, так и местная. Увеличивается спектр ТИ2-цитокинов, наиболее активным из них является интерлейкин-10 (IL-10). EGCG угнетает экспрессию IL-10 в кератиноцитах, снимает локальное UV-индуцированное воспаление, блокирует синтез циклобутановых пиримидиновых димеров - факторов риска UV-ассоциированного рака кожи. В проведенных клинических испытаниях установлено, что после применения EGCG исчезали кожные эритемы, замедлялось фотостарение, а также снижался риск меланомного и не-меланомного рака кожи (54). В других исследованиях также подтверждался защитный эффект EGCG от UV-облучения за счет разных механизмов: предотвращения перекисного окисления липидов и разрушения оксидантных систем клетки и восстановления антиоксидантных ферментов (95), ингибирования транскрипционной активации NF-kB в кератиноцитах (1), блокады АР-1 (55). По мнению Elmets и соавт., 30-минутной аппликации экстракта зеленого чая достаточно для мощной превентивной защиты от UV-облучения (Elmets etal., 2001).

Анти-фотоканцерогенная активность EGCG тестировалась in vivo на мышах SKH-1 (безволосые). Накожная аппликация EGCG в концентрации примерно 1 мг/см2 наносилась в виде крема. Велись наблюдения за размером опухоли, частотой и множественностью опухолевых разрастаний, инцидентами возникновения новых опухолей. EGCG препятствовал онкогенной трансформации папиллом, индуцированной UV-облучением (68). Механизм предотвращения фотоканцерогенеза, по данным других авторов, связан также со значительным ингибированием метилирования ДНК, вызываемого ультрафиолетом (52, 53). При этом долговременная аппликация на коже не вызывала каких-либо признаков токсичности, как локальных, так и системных. Не отмечалось никакого повреждения кожи, потери массы тела, плотности костной ткани; при этом наблюдалось значительное снижение количества белой жировой ткани у животных.

 

Термогенез

 

Механизм индукции термогенеза - еще один интересный аспект, благодаря которому EGCG и некоторые другие фитонутриенты обладают свойством т.н. "сжигателей жира". На основе экстрактов зеленого чая на рынке имеются препараты, позволяющие снизить вес. EGCG ингибирует липазы желудка и панкреаса, при этом стимулируя термогенез (17). Наблюдаемые в процессе клинических испытаний эффекты были настолько сильные, что речь идет не просто о коррекции, а о лечении ожирения: через 3 месяца приема AR25 (ExoliseT, экстракт зеленого чая) у добровольцев вес снизился на 4,6%, объем талии уменьшился на 4,8% (17). Интересные данные получены при изучении совместного влияния катехинов зеленого чая, кофеина и танина. Показано, что от комбинированного приема "катехин+кофеин" наблюдалось наиболее значимое снижение веса, в то время как от остальных комбинаций компонентов результаты были менее значительными. Т.е. кофеин и катехины обладают определенным синергизмом и препятствуют ожирению (106). Уровень триглицеридов, жирных кислот, липопротеидов низкой плотности заметно снижается после употребления EGCG. Кроме того, уменьшается сывороточный уровень адипоцитокина лептина - одного из косвенных показателей степени ожирения организма (85).

Чтобы замкнуть круг, следует, очевидно, связать влияние ожирения на риск развития рака. В рамках данного изложения авторы сочли необходимым порекомендовать читателю недавние полновесные исследования на эту интересную тему: Crew & Neugut, 2004 (27); Furberg et al., 2004 (33); Calle & Kaaks, 2004 (13); Lin et al., 2004 (62), a также более ранние работы.

 

Антиоксидантная активность

 

Свойство EGCG и других чайных катехинов защищать от оксидативного стресса является наиболее изучаемым. Это, по сути, самое первое свойство, благодаря которому EGCG стал рассматриваться как заслуживающее пристального внимания вещество. Антиоксидантная активность EGCG обнаруживается во всех здоровых клетках, в то время как в опухолевых - наоборот, фиксируются про-оксидантные эффекты, вызывающие EGCG-индуцированное повреждение ДНК и апоптоз опухолей. Чем обусловлена такая "интеллектуальная" подстройка и различия в типе клеток - пока не совсем ясно.

Продукция свободных радикалов, приводящая к окислению липидов клеточных мембран, является одним из мощных стимулов, повреждающих клетки и ткани. Усиление оксидативного стресса, в свою очередь, приводит к нарушению естественных антиоксидантных систем. Для предотвращения или коррекции оксидативного стресса применяются различные антиоксиданты, обладающие разной силой защитного ответа. В ряду известных натуральных и синтетических антиоксидантов известны какао, транс-ресвератрол, компоненты зеленого чая, оливкового масла, витамины Е (а-токоферол) и С, некоторые минералы (селен). Кроме того, существует также множество искусственно созданных веществ с аналогичными свойствами - гидроксианизол (butylated hydroxyanisole, ВНА), гидрокситолюэн (butylated hydroxytoluene, BHT), пропил-галлат (PG) (97). В основе механизма антиоксидантного действия всех этих веществ лежит ингибирование окисления липидов формированием относительно слабореактивных свободных радикалов, которые не обладают столь сильным повреждающим эффектом.

В нормальных физиологических условиях небольшие количества кислорода, потребляемого митохондрией, постоянно конвертируются в супероксид анионы, перекись водорода, гидроксильные радикалы. В небольших количествах они выполняют важную роль в регуляции многих клеточных функций и действуют как вторичные мессенджеры на активаторы транскрипции, такие как NF-kB (29). Избыточная продукция этих радикалов является фактором повреждения, и на этот счет в клетке имеется естественная анти-оксидантная система. Она представлена ферментами, среди которых наибольшее значение имеют Мп2+- и Си2+-зависимые супероксид-дисмутазы (SOD, ЕС 1.15.1.1), глютатион пероксидаза (GPX, ЕС 1.11.1.9), глютатион-редуктаза (GR, ЕС 1.8.1.7) и каталаза (CAT, EC 1.11.1.6). SOD конвертирует супероксид-анионы в перекись водорода, которая затем трансформируется в воду другими ферментами, GPX и CAT (98).

На активность антиоксидантных ферментов оказывают влияние также и возрастные изменения, которые выражаются в снижении их экспрессии и уровня в крови и тканях. Наибольший вклад в снижение активности естественных анти-оксидантных систем клетки вносят нарушения респираторной функции митохондрий, снижение митохондриального потенциала, выход цитохрома с, стимуляция про-апоптотических белков теплового шока (HSP10, HSP60), дисбаланс в системе белков Bax/Bcl, активация каспаз-3 и -9, других апоптогенных факторов. Таким образом, гиперпродукция свободных радикалов является также и характеристикой старения, что проявляется токсичностью на разных уровнях - органном, клеточном, генном. Стимуляция естественных антиоксидантных систем, привнесение экзогенных антиоксидантов - ключевой момент лечения и профилактики воспаления, канцерогенеза, раннего старения.

Антиоксидантная активность EGCG была исследована на культуре гепатоцитов крыс. Гепатоциты инкубировались с канцерогенами - беномилом и 1-нитропеном. Воздействие EGCG на клетки мониторировалось измерением малонилальдегида - маркера перекисного окисления липидов, а также изменением активности глютатиона (GSH), глютатион-пероксидазы, глютатион-редуктазы. По сравнению с контролем, концентрация антиоксидантных ферментов увеличилась более чем на 200%, а малонилальдегида уменьшилась на 23% (79).

Антиоксидантные свойства EGCG изучались на животных моделях с почечной недостаточностью, вызванной метилгуанидином (MG). Это уремический токсин, продуцируемый из креатинина под влиянием гидроксильного радикала. Мышам вводился креатинин интраперитонеально. Добавление мышам в питьевую воду EGCG за 30 минут до и после инъекции креатинина способствовало ингибированию продукции MG за счет инактивации гидроксильного радикала (71).

Похожие данные получены при исследовании нейродегенеративных заболеваний - болезни Альцгеймера, Паркинсона, хореи Гентингтона, боковом амиотрофическом склерозе. EGCG выступал в качестве монотерапии и обнаруживал свойства скевенджера свободных радикалов, хелатора металлов (железа и меди), стимулятора защитных анти-оксидантных ферментов, чья экспрессия нарушается в процессе ишемии-реперфузии нейронов, токсическом повреждении, окислении, других повреждающих стимулов (66).

 

Другие антипролиферативные эффекты EGCG

 

EGCG оказывает ингибирующее действие на развитие гипертрофии гладкомышечных клеток, предотвращая, таким образом, развитие атеросклеротических бляшек, утолщения стенок сосудов, гипертензии. Молекулярной основой ингибирования является прямая блокада ангиотензин-И-индуцируемой активности JNK-киназы (c-Jun N-terminal kinase) в гладкомышечных клетках. Для сравнения, другие катехины зеленого чая не обладают аналогичными эффектами (105).

Антифибротические свойства EGCG подтверждены в экспериментах in vitro. Воспалительные изменения в печени диктуют развитие фибротических процессов. На культуре клеток LI90 EGCG ингибировал PDGF-BB - индуцируемую клеточную пролиферацию, а также мРНК коллагенов альфа-l и IV типов (83). В этой работе показано, что EGCG снижает способность к аутофосфорилированию рецептора к PDGF-BB, что прерывает пролиферативный каскад и блокирует фибротические образования в печеночных клетках.

Исследовался эффект EGCG на рост, пролиферацию, апоптоз и теломеразную активность при цервикальном канцерогенезе. Изучались различные дозы EGCG (от 0 до 100 мМ) на культуре первичных эндоцервикальных клеток человека различных линий, в том числе зараженных вирусом папилломатоза (HPV18). Показано, что антиканцерогенный эффект EGCG опосредуется за счет индукции апоптоза и снижении активности теломеразы в клетках диспластического эпителия (103). Цервикальные повреждения, вызванные HPV, нивелировались после употребления 200 мг/день EGCG у добровольцев, либо принимающих катехин в виде капсул в течение 8-12 недель, либо в виде крема местно. Эффект от крема отмечен у 74% пациентов, от приема капсулы - у 50%, а в группе, где использовались оба вида приема EGCG - 75% (3). Эти данные характеризуют EGCG как мощный противовирусный препарат, с направленной активностью на эндотелиальные клетки, к которым HPV имеет высокую тропность.

Модуляция цитохромной системы EGCG исследована in vivo на мышах Swiss-Webster. EGCG вовлечен в метаболизм и синтез эстрадиола - одного из основных эстрогенов с сильной пролиферативной активностью. При добавлении EGCG в различных концентрациях (12.5, 25 или 50 мг/кг/день) были измерены активность ароматазы (CYP19), а также цитохромов Р-450 CYP3A, CYP1A. Под влиянием EGCG активность ароматазы была ингибирована на 56%, активность CYP3A возросла на 31-47%, a CYP1A1 - оставалась неизменной. Эти данные говорят о наличии антипролиферативной активности EGCG на тканях-мишенях ароматазы и эстрадиола (опухоли эндометрия, миометрия, опухоли молочной железы), что объясняет блокаду гиперпластических процессов и противоопухолевые свойства EGCG в тканях репродуктивной системы (38).

Употребление зеленого чая пожилыми женщинами (6576 лет) ассоциировалось с увеличением плотности и минерализации костной ткани, несмотря на гипоэстрогенемию (42). Но этот эффект достигается, очевидно, не за счет катехинов, а за счет фитоэстрогенов чая, которые стимулируют остеобластогенез: EGCG ингибирует щелочную фосфатазу - маркер созревания остеобластов, и никак не влияет на минерализацию кости (101).

Антипролиферативные активности EGCG распространяются и на ТИ2-подтип лимфоцитов. Показано, что это вещество обладает анти-аллергическими свойствами, подавляя экспрессию высокоафинного рецептора к IgE. Известно, что IgE является одним из наиболее ключевых факторов в развитии аллергических реакций. Анти-аллергические свойства EGCG основаны также на блокаде ERK1/2 - сигнального пути, что также ингибирует экспрессию рецептора к IgE.

Таким образом, EGCG является не просто противовоспалительным веществом: влияние на активность Th1- и ТЬ2-подтипа лимфоцитов обеспечивает восстановление Th1/Th2 баланса - свойство, которым не обладает ни один современный иммуномодулирующий препарат, основное назначение которых - лишь активация Т-клеточного ответа (т.е. стимуляция ТМ-звена иммунной системы).

Получены интересные данные об анти-кариесном действии чая: EGCG полностью блокирует глюкозилтрансферазу стрептококков, живущих в ротовой полости (40). Кроме того, EGCG ингибирует продукцию токсических метаболитов Porphyromonas gingivalis - вирулентного микроорганизма, вызывающего пародонтоз. Наблюдалось снижение продукции пропионовой и других кислот, разрушающих зубную эмаль, в концентрации 1-2 мг/мл (82). Makimura и соавторы обнаружили полное ингибирование ферментной активности коллагеназы чайными катехинами у пациентов с острыми гингивитами (65).

На фоне употребления зеленого чая снижался риск развития катаракты: ослабевало помутнение хрусталика за счет снижения преципитации белков, стимулируемое EGCG (92). Сочетание антиангиогенной и антипролиферативной активностей по отношению к эпителиальным клеткам вносит дополнительную ясность в объяснение эффектов EGCG при данной патологии.

Таким образом, EGCG вовлечен практически во все процессы, которыми характеризуется гиперпластический рост. В данном разделе описан один из ярких примеров влияния природных фитонутриентов на предотвращение и блокаду опухолевого роста. Среди многих других не менее интересным представляется другой природный компонент, который способен вмешиваться в гормональный метаболизм и корректировать рост-стимулирующие влияния гормонов (эстрогенов) на клетках. Речь идет об индол-3-карбиноле.

 

Механизмы противоопухолевой активности индол-3-карбинола

 

Индол-3-карбинол (I3C) - компонент овощей семейства крестоцветных (в основном, это все виды капусты: брокколи, цветная, белокочанная, брюссельская) (78). За более чем 10-летнюю историю исследований по I3C показано, что это вещество обладает .высокой избирательной противоопухолевой активностью, влияющей на многие типы клеток, включая клетки молочной железы. Изначально считалось, что I3C оказывает влияние только на те клетки, в которых эстрогены являются факторами, провоцирующими пролиферацию. Однако позже было установлено, что I3C вызывает апоптоз опухолевых клеток вне зависимости от наличия эстрогеновых рецепторов.

 

Анти-эстрогенный эффект

 

Наиболее типичный пример эстрогенной стимуляции - пролиферативные заболевания молочной железы. Наиболее опасным является рак: по данным Всемирной организации Здравоохранения ежегодно регистрируется около 570 тысяч новых случаев. Во всем мире он занимает второе, в России - первое место в ряду смертности от опухолевых заболеваний.

Как было отмечено ранее, одним из необходимых факторов, которые используют как здоровые, так и опухолевые клетки, является эстроген. Взаимодействие эстрогена с рецептором (ER) инициирует проникновение образовавшегося комплекса в ядро, где эстрогеновый рецептор выполняет роль активатора транскрипции, стимулируя экспрессию множества эстроген-стимулируемых генов. Действуя в паракринной и аутокринной манере, вновь синтезируемые белки стимулируют рост самой клетки, а также вовлечены во многие другие антиапоптотические функции. В числе таких генов - изоформы цитохрома Р-450 (CYP450), а именно - CYP1B1. Субстратом для данной формы цитохрома является сам эстроген, в результате чего образуется его гидроксиметаболит, окисленный в 16-м положении, а именно - 16-альфа-гидроксиэстрон (16ссОНЕ1) (63). Эта форма эстрогена обладает наиболее сильной пролиферативной активностью по сравнению как с нативным эстрогеном, так и его любыми другими метаболитами. Именно эта форма эстрогена несет мощный пролиферативный и онкогенный потенциал и способна активировать эстрогенный рецептор (31, 74).

Модуляция цитохромной системы индол-3-карбинолом состоит в индукции другой изоформы CYP450, а именно - CYP1A1 (5). Данная изоформа гидроксилирует эстроген во 2-м положении, с образованием 2-гидроксиэстрона (20НЕ1). Полученный метаболит является антагонистом рецептора эстрогена и блокирует его активацию самим эстрогеном, а также его опасными метаболитами (9). Так прерывается синтез эстроген-зависимых генов, и опухолевая клетка не способна получить эстроген-зависимую сти- | муляцию. В этом суть анти-эстрогенного эффекта I3C.

Применение I3C как противоопухолевого средства в отношении рака молочной железы было начато в 1995 году (9). Было показано, что уровень CYP1A1 регулировался в зависимости от концентрации I3C: ферментная активность CYP450 увеличивалась линейно от 10 до 150 | пмоль/мг белка при дозах от 1 до 500 ммоль I3C на одно животное. В сравнении с другими диетическими индолами, I3C проявлял наиболее сильную СУР1А1-стимулирующую активность, сопровождающуюся повышением 2-гидроксиэстрона. При этом наблюдалась статистически значимая регрессия эстроген-зависимого роста опухолевой ткани по сравнению с таковой в контрольной группе животных.

Нужно отметить, что восприимчивость к I3C довольно вариабельна: индивидуальный ответ проявляется благодаря генетическим вариациям и зависит от индуцибельности CYP1A1. Этот эффект проанализирован в популяциях европейских и африкано-американских женщин: у первых соотношение 2/16а почти в 2 раза выше (2.25+1.42) (89).

 

Модуляция сигнальных путей ростовых факторов

 

Антипролиферативная активность I3C распространяется как на эстроген-зависимые, так и эстроген-независимые клетки, где пролиферативные каскады осуществляются без участия эстрогена (т.е. не имеющих эстрогеновых рецепторов). Напомним, что рост таких клеток чаще всего зависит от активности ростовых факторов, таких как эпидермальный фактор роста (EGF), фибробластический фактор роста (FGF), в том числе фактор роста кератиноцитов (FGF-7 или KGF), инсулино-подобный фактор роста (IGF-I). В отсутствие какого-либо препятствия, ростовые факторы активируют свои рецепторы, обладающие киназной активностью. Лиганд-индуцируемая димеризация рецепторов активирует каскад цитоплазматических киназ (МАРК, Akt), протоонкогенов (fos, ras), активаторов транскрипции (NF-kB), что приводит к синтезу лигандиндуцируемых генов, среди которых - ростовые факторы и рецепторы к ним, цитоплазматические киназы, факторы для роста новых сосудов, белки теплового шока, другие необходимые для опухолевого метаболизма белки. I3C, проникая в клетку, блокирует множество сигнальных путей, препятствуя фосфорилированию тирозиновых остатков киназ, что мешает каскадной передаче пролиферативных сигналов с поверхности к ядру клетки (20). Кроме того, он ингибирует NF-kB, который является основным фактором активации транскрипции множества генов, вовлеченных в пролиферацию и воспаление (12).

Накапливаются данные по ингибированию I3C специфических опухолевых генов. MUC1 - трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся в большинстве карцином. Уровень экспрессии MUC1 ассоциируется со степенью агрессивности опухоли; MUCI-антиген используется в качестве маркера для мониторирования пациентов с опухолями молочной железы. Было показано, что I3C ингибирует экспрессию MUC1 как в эстроген-зависимых (MCF-7), так и эстроген-независимых (MDA-MB-468) клетках, в доза-зависимой и время-зависимой манере, на белковом и транскрипционном уровне (57).

Гены
Функция в опухолевой клетке
Эффект I3C
Вах Цитоплазматический белок, маркер апоптоза. Транслокация в митохондрию сопровождается выходом цитохрома с с последующим вовлечением каспаз 3 и 9 и развитием апоптоза Усиление транскрипции
CDK6 Циклин-зависимая киназа. Стимулирует рост опухолевых клеток, наиболее активна в Gl-фазе клеточного цикла. Эстроген-независима Блокада активности
Akt Киназа, один из участников EGFиндуцируемого сигнального каскада. Стимулирует пролиферацию опухолевых клеток Блокада активности, вызванная нарушением фосфорилирования
p27, р21, р16 CDK-ингибиторы, опухолевые супрессоры Усиление транскрипции
HSP27 Белок теплового шока, выполняющий функцию стабилизации структуры белков, участвующих в пролиферации клеток. Экспрессия многократно повышена. Ингибитор апоптоза. Ассоциирован с агрессивной формой рака молочной железы. Вовлечен в метастазирование Блокада активности
EGF, EGFR, TGFb, FGF Ростовые факторы и их рецепторы. Стимулируют пролиферацию опухолей Ингибирование транскрипции
NF-kB и NF-kB-индуцибельные гены Ядерный фактор активации транскрипции генов, индуцируемых ростовыми факторами. Вовлечен в пролиферацию и выживание опухолевых клеток Ингибирование транскрипции

Еще один механизм блокады опухолевого роста индол-3-карбинолом связан с ингибированием активности циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - фермента, вовлеченного в синтез простагландинов (PGE2). СОХ-2 активируется в ответ на провоспалительные цитокины - фактор некроза опухоли-альфа (TNF-ct) и его "партнера" - интерлейкина-1 (IL-1). Взаимодействие цитокинов со своими рецепторами приводит, в частности, к активации СОХ-2, синтезу PGE2 с последующей транскрипцией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) - основного компонента опухолевого неоангиогенеза.

Таким образом, I3C регулирует баланс про-и антиапоптотических факторов как на уровне транскрипции генов, так и посредством блокады активности зрелых белков. Сведения о влиянии I3C на регуляцию активности ключевых внутриклеточных пролиферативных сигналов суммированы в Таблице 22.

 

Таблица 22. Регуляция I3C транскрипции генов в опухолевой клетке

Гены
Функция в опухолевой клетке
Эффект I3C
CYP1A1 Гидроксилирование эстриола во 2 положении с образованием 2-ОНЕ1 производного, обладающего антипролиферативной активностью Усиление транскрипции через активацию Ah-peцептора
BRCA1 Специфический опухолевый супрессор в клетках молочной железы. Осуществляет блокаду транскрипции генов, индуцируемых ERa Усиление транскрипции

 

I3C обладает мощным антипролиферативным эффектом, позволяющим ингибировать воспаление, рост и пролиферацию опухолевых клеток, в том числе зараженных вирусом папилломатоза, а также рост новых сосудов. Кроме того, отмечен прямой апоптотический эффект I3C на опухолевые клетки: I3C усиливает экспрессию естественных опухолевых супрессоров, р21 и р53, которые, в свою очередь, являются ингибиторами циклин-зависимой киназы (CDK) - основного стимулятора опухолевого клеточного цикла (11, 26).

 

Противовирусный потенциал I3C в отношении вируса папилломатоза человека

 

Относительно недавно установлен еще один необычный эффект I3C: он вызывает апоптоз клеток, зараженных вирусом папилломатоза человека, в том числе теми типами вируса, которые обладают онкогенным потенциалом (23, 88). С учетом трудностей, сопровождающих терапию папилломатоза слизистых, данное свойство делает I3C незаменимым противовирусным препаратом с параллельной стимуляцией Т-клеточного звена иммунитета.

 

Медико-социальные аспекты папилломатоза

 

Вирус папилломатоза человека (HPV) имеет очень широкую распространенность; согласно данным ВОЗ, носителями HPV являются 23% населения земного шара, по другим данным - все 60%. Кожные папилломы, остроконечные кондиломы, рак агоненитальной области (шейки матки, вульвы, влагалища), ювенильный папилломатоз гортани (веррукозный ларингит), бородавчатая эпидермодисплазия - вот неполный перечень заболеваний, которые ассоциируются с этой инфекцией. Папилломатозом старадают как взрослые, так и дети: случаи папилломатоза гортани у новорожденных - явление не такое уж и редкое. Первые признаки могут появиться уже в 6-месячном возрасте, и если не предпринимать ургентных мер, быстровырастающие гроздеобразные папилломы могут привести к асфиксии. Совершенно очевидно, что хирургическое лечение эффективно только до следующего рецидива, который наступает очень быстро. Больные папилломатозом гортани переносят до 200 операций ежегодно.

Распространение заболеваемости цервикальным раком в развивающихся странах сродни эпидемии. Все сексуально активное население так или иначе находится в группе риска. Ежегодно регистрируется более 500 тысяч новых случаев в мире. Рак шейки матки является первым опухолевым заболеванием, для которого однозначно идентифицирован этиологический фактор. Эпидемиологические и лабораторные исследования установили, что основной причиной является вирус папилломатоза человека (ВПЧ), обнаруженный в 100% случаев.

Примерно 30 типов вируса папилломатоза инфицируют генитальный тракт, а четыре из них (ВПЧ 16, 18,31 и 45 типа) вносят значительный (до 80%) вклад в эту статистику.

Лечение цервикального рака в настоящее время довольно сложное, и далеко не всегда проходит удачно. Диагностические критерии отсутствовали до недавнего времени: трудность заключается в том, что 90% случаев генитального папилломатоза заканчивается спонтанной ремиссией, а 10% случаев - малигнизацией. В случае ремиссии никаких клинических проявлений обычно нет, но вирус остается в организме, что сохраняет риск заражения партнеров и развития неоплазий.

 

 

HPV-онкомаркеры

 

В последнее время идентифицированы антигены, являющиеся специфическими для HPV-ассоциированных инфекций. Наибольшее диагностическое и клиническое значение имеют два белка, онкобелки - маркеры Е6 и Е7. Во многих случаях вирус папилломатоза интегрируется в геном зараженных клеток хозяина, при этом наблюдается повышение экспрессии этих антигенов на клеточной поверхности. Они довольно иммуногенны, хорошо распознаются Т-лимфоцитами организма и являются, таким образом, специфическими Т-антигенами. Онкобелки проявляют свой эффект через формирование комплексов со специальными белками - р53 и pRb1), которые обычно выполняют в клетке противоопухолевую функцию. В связанном с онкобелками состоянии они не способны выполнять эти функции, что вызывает снижение внутриклеточных противоопухолевых систем защиты. Инактивация р53 и Rb вызывает нарушения в клеточном цикле клетки, что способствует дальнейшей "генетической нестабильности" и развитию дополнительных генетических альтераций. Необходимо отметить, что, в зависимости от активности вируса, блокада противоопухолевых свойств этих белков происходит с разной силой: у вирусов с высоким потенциалом развития опухолей комплексы "Е6-р53" и "E7-Rb" более стабильны.

Молекулярные механизмы иммортальности клетки, зараженной вирусом, определены благодаря изучению регулирующих активностей онкобелков Е6 и Е7. Как обычно бывает, воздействие онкогена не ограничивается вмешательством в какой-то конкретный сигнальный путь. Еб и Е7 также вмешиваются в регуляцию тех путей, принципиально необходимых клетке для выживания. Один из них - прямая регуляция активности ядерных рецепторов - тироидных (TR), андрогеновых (AR), эстрогеновых (ER). Еб и Е7 обладают способностью образовывать с ними комплексы и активировать их транскрипционный потенциал. Функциональная роль этих белков зависит от клеточного типа, особенностей промоторного региона, а также самого ядерного рецептора. К примеру, регуляция ER происходит через АР-1 и АР-2 сайты - т.е. те участки промотора эстрогенового рецептора, через которые осуществляется основная регуляторная роль и стимуляция транскрипции эстроген-зависимых генов. Вторая причина - подавление транскрипции TGF-p, выполняющего в некоторых типах клеток функции опухолевого супрессора. Показано, что HPV 16 Е7 значительно подавляет промоторную активность одной из изоформ TGFp - TGFp-2 в клетках NIH/3T3 (дикий тип, имеющий опухолевые супрессоры р53 и pRb). Необходимым условием блокирования TGFp-промоторной активности является взаимодействие Е7 с pRb.

Супрессоры опухолевого роста р53 и pRb вовлечены также в регуляцию экспрессии про-и анти-ангиогенных факторов, и их блокада в HPV-клетках, очевидно, должна нарушать регуляторные механизмы ангиогенеза. Вопрос об альтерациях онкобелков в процесс неоангиогенеза исследовался в следующем эксперименте. Кератиноциты человека были инфицированы рекомбинантным ретровирусом, экспрессирующим Еб и Е7 (93). RT-PCR, ELISA и Вестерн-блот показали, что в клетках, экспрессирующих HPV 16 Еб и Е7, экспрессионный уровень двух ингибиторов ангиогенеза, тромбоспондина-1 и маспина, был даже ниже, чем в контроле. При этом наблюдалась гиперэкспрессия основных стимуляторов ангиогенеза - VEGF и IL-8. В HPV-зараженных кератиноцитах отмечались продукты альтернативного сплайсинга VEGF - изоформы VEGF12v VEGF145> VEGF165 и VEGF18g. Стимулирование опухолевого вирус-индуцированного ангиогенеза - еще один механизм, объясняющий иммортальность HPV-зараженных клеток. В дополнение к этому можно отметить Е6стимулированную активацию МАРК-сигнальных антиапоптотических каскадов (16), индукцию теломеразы в кератиноцитах белком Еб HPV 16 типа (75, 76), повышение активности СОХ-2 в клетках с цервикальной дисплазией (37, 56), экспрессии матриксных металлопротеиназ (90), урокиназы (иРА) (81,94), катастрофическое снижение соотношения Bax/Bcl в HPV-инфицированных клетках (70), многих других антиапоптотических стимулов.

 

Иммуномодулирующий эффект I3C

 

Относительно недавно появились новые исследования, касающиеся одной из наиболее важных составляющих активностей I3C. Блокада пролиферативных стимулов - не единственная роль I3C в HPV-инфицированной клетке. Сочетания противоопухолевых и противовирусных эффектов I3C исследовали Chatterji с соавторами (18). Оказалось, что в промоторной области рецептора к интерферону-гамма (IFN-yR1) имеются сайты связывания для I3C. Попадание в клетку I3C запускает, кроме всего прочего, транскрипцию IFN-yR1, что, в свою очередь, стимулирует восприимчивость опухолевых клеток к интерферону (IFN-y). Этот эффект был проверен авторами на клетках опухоли молочной железы. Показано, что комбинационное использование I3C и IFN-y активирует STAT 1-белки усилением фосфорилирования тирозина Tyr7ov Кроме того, синергизм этих компонентов вызывает прекращение клеточного цикла в G1 фазе и стимулирует экспрессию р21, ингибитора клеточного цикла. Эти интереснейшие данные вносят дополнительный вклад в объяснение необычной полифункциональности индол-3-карбинола и также объясняют его противовирусный эффект: интерфероны 2 типа, к которым относится IFN-y, являются сильнейшими факторами с мощной противовирусной активностью.

Связывание интерферонов с рецептором индуцирует экспрессию ряда новых генов в клетке-мишени. Это нуклеазы, синтазы и протеинкиназы, которые оказывают влияние на белковый синтез и ответственны за проявление антивирусной активности. В частности, вновь синтезированные протеинкиназы инактивируют фактор инициации elF2a и таким образом ингибируют синтез вирусных белков. Экспрессия другого интерферон-индуцируемого фермента - 2',5'-полиаденилат синтазы, способствует активации эндонуклеаз, которые подвергают деградации вирусную мРНК.

 

Влияние на плотность кости

 

Ингибирование активности эстрогенов индол-3-карбинолом теоретически должно приводить к остеопорозу, т.е. усилению стимуляции остеокластогенеза. Однако наблюдения in vivo опровергают эти опасения: показано, что одна из форм индол-3-карбинола, DIM, усиливает активность щелочной фосфатазы, маркера остеобластогенеза, в 4 раза. Повышение тРНК щелочной фосфатазы происходит за счет активации TGF-(5 - ростового фактора, индуцируемого индол-3-карбинолом. Последнее свойство очень ценно, так как TGF-J3- это как раз тот цитокин, который модулирует (трансформирует) клеточный рост: стимулирование его экспрессии в опухолях способствует замедлению роста опухолевой клетки. Рекомбинантные изоформы TGF-p вовлечены в дифференцировку многих типов опухолевых клеток in vitro и in vivo, выступая, таким образом, в качестве опухолевых супрессоров.

 

Механизм апоптоза опухолевых клеток под влиянием I3C

 

К настоящему времени определены ключевые механизмы и факторы, вовлеченные в развитие апоптотического процесса клеток-мишеней. Нарушение баланса анти- и проапоптотических факторов сдвигает равновесие в пользу какого-то из них, в случае преобладания последних регистрируется гибель клетки. Одними из важнейших в этом процессе рассматриваются белки семейства Вс1-2, среди которых - Вах, Bcl-2, BCI-XL > некоторые другие. Вах индуцирует апоптоз, в то время как Bcl-2, Bcl-XL - ингибируют его развитие. Показано, что отношение Вах:Вс1-2 является наиболее важным показателем апоптоза опухолевых клеток, индуцируемого противоопухолевыми препаратами (67). Кроме того, комплексный анализ апоптоза подразумевает изучение внутриклеточной локализации белка Вах. Транслокация цитозольного Вах в митохондрию индуцирует выход цитохрома с, который активирует каспазы-3 и -9, являющиеся ключевыми в последовательности апоптотических процессов (8, 32).

Под влиянием I3C в опухолевых клетках молочной железы происходит модуляция экспрессии генов, вовлеченных в апоптоз. Так, на клеточных моделях MCF10A и СА1а, являющимися нормальными и опухолевыми эпителиальными клетками молочной железы, показано, что I3C значительно блокирует экспрессию Bcl-2 в опухолевых СА1а клетках, в то время как в здоровых MCF10A - нет (78, 84). В обоих типах клеток регистрировалась транслокация Вах в митохондрию, однако потеря митохондриального потенциала, выход цитохрома с и индукция апоптоза наблюдались только в опухолевых клетках. Как видно из этих наблюдений, транслокации Вах в митохондрию недостаточно для индукции апоптоза; необходимы дополнительные механизмы, вовлекающие митохондриальную деполяризацию с последующей активацией про-апоптотических каспаз. Все эти события в опухолевой клетке индуцирует I3C.

Еще два сигнальных пути, а именно - Akt (митоген-активируемая протеинкиназа) и NF-kB, вовлечены во взаимодействие с белками семейства Bcl-2 и являются важнейшими регуляторами программы выживания клетки.

Сигнальные пути, в которые вовлечена киназа Akt, ведут к анти-апоптотическим событиям в нормальных и опухолевых клетках. В норме они активируются в ответ на стимулы от ростовых факторов, обладающих также и митогенными активностями, и приводят к росту клеток-мишеней, а в случае опухолевой трансформации - пролиферации клеток. В регуляции активностей факторов, вовлеченных в каскад индуцируемых митогенами реакций, Akt играет важную роль. Она осуществляет анти-апоптотические функции за счет многих механизмов. В частности, ингибирует конформационные изменения белка Вах, тем самым предотвращая его транслокацию в митохондрию, что, в свою очередь, предотвращает потерю потенциала внутренней митохондриальной мембраны, активацию цитохрома с и развитие апоптоза (45).

I3C оказывает терапевтическое воздействие на эпителиальные клетки, одновременно являющиеся тканями-мишенями эстрогенов. Сигнальными молекулами, индуцирующими запуск пролиферативного механизма в этих клетках, являются, среди прочих, эндотелиальный фактор роста (EGF), его рецепторы (EGFR) и эстрогены. EGF, взаимодействуя со своими рецепторами, индуцирует сигнальный каскад с вовлечением специфических цитоплазматических белков (РОК, Akt). Активация этого пути в клетке ведет к стимуляции ее пролиферации. В свою очередь, взаимодействие эстрогенов со своими рецепторами приводит к фосфорилированию ассоциированного с рецептором белка теплового шока HSP27, выполняющего анти-апоптотические функции в клетке (15, 35). HSP27 экспрессируется в опухолях млекопитающих и его экспрессия многократно повышается после стимуляции эстрогенами (22, 77). Таким образом, существуют две возможности выживания опухолевой эстроген-зависимой эпителиальной клетки.

Уникальность действия I3C заключается в том, что он вмешивается в оба эти пути, нарушая внутриклеточные каскады и препятствуя клеточной пролиферативной активности. С одной стороны, он обладает антиэстрогенным эффектом, стимулируя образование анти-пролиферативного 2-гидроксиэстрона, а с другой - препятствует фосфорилированию цитоплазматических белков - участников каскадной передачи, индуцируемой EGF. Блокирование антиапоптотического пути в эпителиальной клетке - суть антиопухолевого эффекта индол-3-карбинола на тех опухолях, на которых повышена экспрессия рецепторов к EGF.

 

Сравнение активностей тамоксифена и индол-3 карбинола

 

В последние 30 лет самым популярным препаратом, назначаемым при лечении пролиферативных заболеваний молочной железы, был и остается тамоксифен. Тем не менее, в литературе накапливаются данные о том, что длительный прием тамоксифена сопровождается рядом нежелательных побочных эффектов.

Успех лечения от тамоксифена определяется, в основном, наличием эстрогеновых рецепторов на клетках карцином молочной железы. При этом примерно у половины пациентов с эстроген-зависимой формой опухоли происходит довольно быстрое улучшение, тогда как у остальных заболевание прогрессирует и развивается тамоксифенустойчивый фенотип, что ставит под сомнение и делает небезопасным дальнейшее применение этого препарата: показано, что длительный прием тамоксифена зачастую приводит к развитию опухолей в здоровых тканях, и на этот счет имеется множество публикаций (10, 24, 28, 39, 58, 72). В частности, тамоксифен ассоциирован с риском развития опухолей эндометрия (19,44). Показано, что на фоне приема тамоксифена частота опухолей эндометриального происхождения выросла в 2-3 раза и составляет 80 случаев на 10000 (4). По мнению этих авторов, механизм опухолевой индукции связывают с блокадой тамоксифеном гена р53 - естественного супрессора опухолей. У здоровых субъектов р53 "посылает" сигналы к прекращению клеточного цикла, и, если в цикл вовлечена атипичная клетка, вызывает ее деструкцию. И если подобная активность тамоксифена, несомненно, полезна для усиления чувствительности раковой клетки к химиотерапии, в здоровой клетке этот феномен провоцирует нарушение устойчивости к развитию тамоксифен-зависимого рака.

Таким образом, индол-3-карбинол отчасти похож натамоксифен по тем показателям, которые направлены на гибель опухолевых клеток. Он также прерывает клеточный цикл. Однако его анти-опухолевая активность выше и безопаснее, чем у тамоксифена. Сравнительный анализ антиопухолевой активности показал, что тамоксифен вызывает 60%-ную гибель клеток, тогда как индол-3-карбинол - 90% (25). Важным отличием между ним является тот факт, что в ER-негативных опухолях индол-3-карбинол прекращает синтез ДНК вновь образованных клеток, в то время как тамоксифен аналогичным эффектом не обладает. Индол-3-карбинол восстанавливает р21, р53 и другие опухолевые супрессоры, которые работают в процессе синтеза новых клеток. Тамоксифен же вызывает в них мутации (80). В отличие от тамоксифена, индол-3-карбинол вызывает апоптоз клеток, вызванных химическими канцерогенами, в том числе и диоксином. Остается добавить, что индол-3-карбинол малотоксичен. Согласно клиническим испытаниям, в дозе, многократно превышающей терапевтическую, которая составляет 400 мг/день, индол-3карбинол не вызывает никаких побочных эффектов.

Таким образом, можно вычленить ряд преимуществ индол-3-карбинола перед тамоксифеном. Во-первых, индол-3-карбинол не имеет побочных эффектов, в то время как тамоксифен вызывает ряд последствий, которые превращаются в самостоятельные заболевания. Во-вторых, лечение индол-3-карбинолом основного заболевания (например, опухолей молочной железы) сопровождается параллельной защитой органов и тканей от возникновения опухолей любого происхождения, будь то результат метастазирования, либо химическая индукция веществами из пищи или окружающей среды. Кроме того, спектр применения индол-3-карбинола гораздо выше, чем тамоксифена: последний проявляет избирательную активность исключительно на эстроген-зависимых опухолях, в то время как индол-3-карбинол вызывает апоптоз опухолевых клеток вне зависимости от того, чем вызван их рост - эстрогеном, либо эпидермальным фактором роста, иными стимулами. Отсюда вытекает еще одно важное свойство данного вещества: его противоопухолевая активность распространяется не только на клетки молочной железы, но и на другие ткани, где работает EGF и другие ростовые факторы - простата, желудок, пищевод, мочевой пузырь, щитовидная железа и т.д. Очевидно, что лечение индол-3-карбинолом опухолей вышеназванных тканей - вопрос самого ближайшего будущего.

Сравнительный анализ активностей тамоксифена и индол-3-карбинола приведен в Таблице 23.

 

Таблица 23. Сравнение активностей индол-3 карбинола и тамоксифена

Индол 3 карбинол
Тамоксифен
Усиливает конверсию эстрона в "слабый" эстроген, 20НЕ1, обеспечивая профилактический и терапевтический эффект на эстроген-зависимые опухоли Смещает равновесие 20НЕ1/16аОНЕ1 в пользу 16аОНЕ1
Проявляет эффекты как на эстроген-зависимых, так и эстроген-независимых клетках Работает только на эстрогенпозитивных клетках опухоли молочной железы
Ингибирует рост и вызывает апоптоз MCF7 клеток опухоли молочной железы на 90% Ингибирует рост и вызывает апоптоз MCF7 клеток опухоли молочной железы на 60%
Защищает клетки от токсинов, диоксина (профилактика опухолей) Не обладает защитными свойствами против химически-индуцированных опухолей
Восстанавливает р21 - супрессор опухолей Вызывает мутации р21, р53
Вмешивается в пути, индуцируемые другими пролиферативными сигналами (с участием ростовых факторов, цитоплазматических киназ, активаторов транскрипции) Не блокирует пролиферацию опухолевых клеток, чей рост не индуцируется эстрогеном
Вызывает апоптоз всех эстроген-зависимых, эстроген-независимых опухолевых клеток, блокирует и предупреждает рост опухолей других органов и тканей Индуцирует рост опухолей в эстроген-зависимых тканях (эндометрий)
Обеспечивает антиоксидантную защиту Не обладает анти-оксидантной функцией

 

Представленные данные неопровержимо доказывают преимущество индол-3-карбинола в терапии пролиферативных заболеваний молочной железы, к которым, вообще говоря, относится не только рак. Не меньшей проблемой перед маммологами стоит мастопатия. И если узелковую форму можно лечить хирургически, то диффузный вариант такому лечению не поддается. Поэтому и в этом случае объектом для терапии выбора может стать индол-3-карбинол.

Вместе с тем молекулярные механизмы, благодаря которым I3C вызывает избирательную гибель именно опухолевых клеток, еще малоизучены. Как видно из накопленных к настоящему времени данных, мы имеем лишь констатацию противоопухолевой активности I3C и пока не можем понять, как это вещество "отличает" опухолевые клетки от здоровых. Скорее всего, I3C лишь использует механизмы, которыми отличаются опухоли, постоянно живущие в условиях метаболического стресса. Эти°механизмы направлены на регуляцию пролиферативной активности опухолевой клетки, ее выживание в условиях стресса, поддержание относительно постоянного гомеостаза. А это, в свою очередь, достигается усилением транскрипционного контроля белковых факторов, ответственных за эти процессы. Так, например, в клетках молочной железы повышена экспрессия ростовых факторов и их мембранно-связанных рецепторов (EGF, EGFR), факторов транскрипции (субъединиц NF-kB, SP-1, других активаторов транскрипции), ядерных рецепторов (в частности, рецепторов к эстрогенам), а также Ah-рецептора. I3C использует свой потенциал воздействия на сигнальные пути, индуцируемые указанными факторами, которых несравнимо больше в опухолевой, чем в здоровой клетке. Это, в свою очередь, приводит к кажущейся "избирательности" действия I3C, что на самом деле можно объяснить большей вероятностью взаимодействия. В пользу этого рассуждения говорит также тот факт, что потенциальными мишенями I3C являются, вообще говоря, все солидные опухоли, рост которых напрямую и не зависит от эстрогенов, и пролиферация которых проходит в эстроген-независимой манере (например, эстроген-независимые опухоли молочной железы, опухоли простаты). При этом никакой избирательности между разными типами опухолей I3C не проявляет. Просто там больше потенциальных объектов для взаимодействия. Другими словами, опухоль сама "предоставляет" множество объектов для проявления
противоопухолевых активностей I3C.

Не менее интересным является свойство I3C предотвращать развитие опухолей, особенно когда речь идет о химически-индуцированном канцерогенезе. Вредное влияние окружающей среды вносит свой вклад в повышение риска мутагенности, нарушение метаболизма, сбоя защитных систем клетки, что немедленно сказывается на статистике смертей от опухолей в индустриально развитых странах. Мутагены, онкогены, циклические углеводороды, яды проникают в организм и накапливаются в тканях. Своеобразными "токсикологическими" воротами клетки служит Ah-рецептор, лигандами которого являются ариловые углеводороды. Долгое время не было известно ни одного природного лиганда для этого рецептора. Сейчас установлено, что один из них - индол-3-карбинол. Он служит селективным модулятором Ah-рецептора, изменяет его функции в плане регуляции экспрессии эстроген-зависимых генов и обладает сильным превентивным эффектом от активации Ah его химическими лигандами, такими, как, например, диоксин.

 

Список литературы к Главе 8

  1. Afaq F., Adhami V.M., Ahmad N., Mukhtar H. Inhibition of ultraviolet B-mediated activation of nuclear factor kappaB in normal human epidermal keratinocytes by green tea Constituent (-)-epigallocatechin-3-gallate. Oncogene, 2003, Feb 20, 22(7), 1035-44.
  2. Ahmed S., Wang N., Lalonde M., Goldberg V.M., Haqqi T.M. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate (EGCG) differentially inhibits interleukin-1 beta-induced expression of matrix metalloproteinase-1 and -13 in human chondrocytes. J Pharmacol Exp Ther. 2004, Feb, 308(2), 767-73.
  3. Ahn W.S., Yoo J., Huh S.W., Kim C.K., Lee J.M., Namkoong S.E., Bae S.M., Lee IP. Protective effects of green tea extracts (polyphenon E and EGCG) on human cervical lesions. Eur J Cancer Prev, 2003, Oct, 12(5), 383-90.
  4. Altaras M.M., Aviram Ft., Beyth Y. Tamoxifen-associated endometrial carcinoma in postmenopausal breast cancer patients. Gynecol Oncol, 1991, 41,3,270.
  5. Auborn K.J., Fan S., Rosen E.M., Goodwin L, Chandraskaren A., Williams D.E., Chen D., Carter Т.Н. lndole-3-carbinol is a negative regulator of estrogen. J Nutr, 2003, Jul, 133(7 Suppl), 2470S-2475S.
  6. August D.A., Landau J., Caputo D., Hong J., Lee M.J., Yang C.S. Ingestion of green tea rapidly decreases prostaglandin E2 levels in rectal mucosa in humans. Cancer Epidemiol, 1999, 8, 709-713.
  7. Bertolini F., Fusetti L, Rabascio C, Cineri S., Martinellil G., Pruneri G. Inhibition of angiogenesis and induction of endothelial and tumor cell apoptosis by green tea in animal models of human high-grade non-Hodgkin's lymphoma. Leukemia, 2000,14,1477-1482.
  8. Blanc C, Deveraux Q.L., Krajewski S., Janicke R.U., Porter A.G., Reed J.C., Jaggi R., Marti A. Caspase-3 is essential for procaspase-9 processing and cisplatin-induced apoptosis of MCF-7 breast cancer cells. Cancer Res, 2000, Aug 15, 60(16), 4386-90.
  9. Bradlow HI., Telang NT., Sepkovic D.W., Osborne M.P. 2-hydroxyestrone, the 'good' estrogen. J Endocrinol, 1996, Sep, 150 Suppl, S259-65.
  10. Braithwaite R.S., Chlebowski R.T., Lau J., George S., Hess R., Col
    N.F. Meta-analysis of vascular and neoplastic events associated with tamoxifen. J Gen Intern Med, 2003, Nov, 18(11), 937-47.
  11. Brandi G., Paiardini M., Cervasi В., Fiorucci C, Filippone P., De Marco C, Zaffaroni N.. Magnani M. A new indole-3-carbinol tetrameric derivative inhibits cyclin-dependent kinase 6 expression, and induces G1 cell cycle arrest in both estrogen-dependent and estrogen-independent breast cancer cell lines. Cancer Res, 2003, Jul 15, 63(14), 4028-36.
  12. Brignall M.S. Prevention and treatment of cancer with indole-3-carbinol. Altern Med Rev, 2001, Dec, 6(6), 580-9.
  13. Calle E.E, Kaaks R. Overweight, obesity and cancer, epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nat Rev Cancer, 2004, Aug, 4(8), 579-91.
  14. Cao Y., Cao R. Angiogenesis inhibited by drinking tea. Nature, 1999, 398,381.
  15. Cardoso F., Di Leo A., Larsimont D., Gancberg D., Rouas G., Dolci S., Ferreira F., Paesmans M., Piccart M. Evaluation of HER2, p53, bcl-2, topoisomerase ll-alpha, heat shock proteins 27 and 70 in primary breast cancer and metastatic ipsilateral axillary lymph nodes. Ann Oncol, 2001, May, 12(5), 615-20.
  16. Chakrabarti O., Veeraraghavalu K., Tergaonkar V., Liu Y., Androphy E.J., Stanley M.A., Krishna S. Human papillomavirus type 16 E6 amino acid 83 variants enhance E6-mediated МАРК signaling and differentially regulate tumorigenesis by notch signaling and oncogenic Ras. J Virol, 2004, Jun, 78(11), 5934-45.
  17. Chantre P., Lairon D. Recent findings of green tea extract AR25 (Exolise) and its activity for the treatment of obesity. Phytomedicine, 2002, Jan, 9(1), 3-8.
  18. Chatterji LL, Riby J.E., Taniguchi Т., Bjeldanes E.L., Bjeldanes L F , Firestone GL lndole-3-carbinol stimulates transcription of the interferon gamma receptor 1 gene and augments interferon responsiveness in human breast cancer cells. Carcinogenesis, 2004, Feb 26.
  19. Chen P., Yang C.C., Chen Y.J., Wang P.H. Tamoxifen-induced endometrial cancer. Eur J Gynaecol Oncol, 2003, 24(2), 135-137.
  20. Chinni S.R., Sarkar F.H. Akt inactivation is a key event in indole-3carbinol-induced apoptosis in PC-3 cells. Clin Cancer Res, 2002, Apr, 8(4), 1228-36.
  21. Chung J.H., Han J.H., Hwang E.J., Seo J.Y., Cho K.H., Kim K.H., Youn J.I., Eun H.C. Dual mechanisms of green tea extract (EGCG)-induced cell survival in human epidermal keratinocytes. FASEB J, 2003, Oct, 17(13), 1913-5.
  22. Ciocca D.R., Luque E.H. Immunological evidence for the identity between the hsp27 estrogen-regulated heat shock protein and the p29 estrogen receptor-associated protein in breast and endometrial cancer. Breast Cancer Res Treat, 1991, 20(1), 33-42.
  23. Coll D.A., Rosen C.A., Auborn K" Potsic W.P., Bradlow H i . Treatment of recurrent respiratory papillomatosis with indole-3-carbinol. Am J Otolaryngol, 1997, Jul-Aug, 18(4), 283-5.
  24. Couillard S., Gutman M., Labrie C, Belanger A., Candas В., Labrie
    F. Comparison of the effects of the antiestrogens EM-800 and tamoxifen on the growth of human breast ZR-75-1 cancer xenografts in nude mice. Cancer Res, 1998, Jan 1, 58(1), 60-4.
  25. Cover СМ., Hsieh S.J., Cram E.J., Hong C, Riby J.E., Bjeldanes L.F., Firestone G.L. lndole-3-carbinol and tamoxifen cooperate to arrest the cell cycle of MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Res, 1999, Mar 15, 59(6), 1244-51.
  26. Cram E.J., Liu B.D., Bjeldanes L.F., Firestone G.L. lndole-3-carbinol inhibits CDK6 expression in human MCF-7 breast cancer cells by disrupting Sp1 transcription factor interactions with a composite element in the CDK6 gene promoter. J Biol Chem, 2001, Jun, 22, 276(25), 22332-40.
  27. Crew K.D., Neugut A.I. Epidemiology of upper gastrointestinal malignancies. Semin Oncol, 2004, Aug, 31(4), 450-64.
  28. Curtis R.E., Freedman D.M., Sherman M.E., Fraumeni J.F. Jr. Risk of malignant mixed mullerian tumors after tamoxifen therapy for breast cancer. J Natl Cancer Inst, 2004, 96,1, 70-74.
  29. Dalton T.P., Shertzer H.G., Puga A. Regulation of gene expression by reactive oxygen. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1999, 39, 67-101.
  30. Detmar M. Evidence for vascular endothelial growth factor (VEGF) as a modifier gene in psoriasis. J Invest Dermatol, 2004, Jan, 122(1), XIV-XV.
  31. Firestone G.L., Bjeldanes L.F. lndole-3-carbinol and З-З'-diindolylmethane antiproliferative signaling pathways control cell-cycle gene transcription in human breast cancer cells by regulating promoter-Sp1 transcription factor interactions. J Nutr, 2003, Jul, 133(7 Suppl), 2448S-2455S.
  32. Friedrich К., Wieder Т., Von Haefen С, Radetzki S., Janicke R., Schulze-Osthoff K., Dorken В., Daniel P.T. Overexpression of caspase-3 restores sensitivity for drug-induced apoptosis in breast cancer cell lines with acquired drug resistance. Oncogene, 2001, May, 17, 20(22), 2749-60.
  33. Furberg A.S., Veierod M.B., Wilsgaard Т., Bernstein L, Thune I. Serum high-density lipoprotein cholesterol, metabolic profile, and breast cancer risk. J Natl Cancer Inst, 2004, Aug, 4, 96(15), 1152-60.
  34. Garbisa S., Sartor L, Biggin S, Salvato В., Benelli R., Albini A. Tumor gelatinases and invasion inhibited by the green tea flavanol epigallocatechin-3-gallate. Cancer, 2001, 91, 822-832.
  35. Garrido C, Schmitt E., Cande C, Vahsen N., Parcellier A., Kroemer
    G. HSP27 and HSP70: potentially oncogenic apoptosis inhibitors. Cell Cycle, 2003, Nov-Dec, 2(6), 579-84.
  36. Gohji K., Nakajima M., Boyd D, Dinney СР., Bucana CD., Kitazana S., Kamidono S., Fidler I.J. Orgap-site dependence for the production of urokinase-type plasminogen activator and metastasis by human renal cell carcinoma cells. Am J Pathol, 1997, Dec, 151(6), 1655-61.
  37. Golijanin D., Tan J.Y, Kazior A., Cohen E.G., Russo P., Dalbagni G., Auborn K.J., Subbaramaiah K., Dannenberg A.J. Cyclooxygenase-2 and microsomal prostaglandin E synthase-1 are overexpressed in squamous cell carcinoma of the penis. Clin Cancer Res, 2004, Feb, 1,10(3), 1024-31.
  38. Goodin M.G., Rosengren R.J. Epigallocatechin gallate modulates CYP450 isoforms in the female Swiss-Webster mouse.Toxicol Sci, 2003, Dec, 76(2), 262-70.
  39. Gottardis M.M, Jordan V.C Development of tamoxifen-stimulated growth of MCF-7 tumors in athymic mice after long-term antiestrogen administration. Cancer Res, 1988, 48, 5183-5187.
  40. Hamada S., Ooshima Т., Fijiwara Т., Minami Т., Kimura S. Development of preventive measures based on the aetiology of dental caries-a review. Microb Ecol Health Dis, 1996, 9, 349-357.
  41. Hashiya N., Jo N., Aoki M., Matsumoto K., Nakamura Т., Sato Y., Ogata N., Ogihara Т., Kaneda Y., Morishita R. In vivo evidence of angiogenesis induced by transcription factor Ets-1, Ets-1 is located upstream of angiogenesis cascade. Circulation, 2004, Jun, 22,109(24), 3035-41.
  42. Hegarty V.M., May H.M., Khaw K.T. Tea drinking and bone mineral density in older women. Am J Clin Nutr, 2000, 71,1003-1007.
  43. Hong J., Smith T.J., Но СТ., August D.A., Yang C.S. Effects of purified green and black tea polyphenols on cyclooxygenase- and lipoxygenase-dependent metabolism of arachidonic acid in human colon mucosa and colon tumor tissues. Biochem Pharmacol, 2001, 62,1175-1183.
  44. Houghton J.P, loffe O.B., Silverberg S.G., McGrady B, McCluggage W.G. Metastatic breast lobular carcinoma involving tamoxifen-associated endometrial polyps: report of two cases and review of tamoxifen-associated polypoid uterine lesions. Mod Pathol, 2003, Apr, 16(4), 395-8.
  45. Howells L.M., Gallacher-Horley В., Houghton C.E., Manson M.M., Hudson E.A. lndole-3-carbinol inhibits protein kinase B/Akt and induces apoptosis in the human breast tumor cell line MDA MB468 but not in the nontumorigenic HBL100 line. Mol Cancer Ther, 2002, Nov, 1(13), 1161-72.
  46. Huang S., New L, Pan Z., Han J., Nemerow G.R. Urokinase plasminogen activator/urokinase-specific surface receptor expression and matrix invasion by breast cancer cells requires constitutive p38alpha mitogen-activated protein kinase activity. J Biol Chem, 2000, 275,12266-12272.
  47. Jankun J., Keck R.W., Skrzypczak-Jankun E., Swiercz R. Inhibitors of urokinase reduce size of prostate cancer xenografts in severe combined immunodeficient mice. Cancer Res, 1997a, 57, 559-563.
  48. Jankun J., Selman S.H., Swiercz R., Skrzypczak-Jankun E. Why drinking green tea could prevent cancer. Nature, 1997b, 387, 561.
  49. Jeong W.S., Kim I.W., Hu R., Kong A.N. Modulatory properties of various natural chemopreventive agents on the activation of NF-kappaB signaling pathway. Pharm Res, 2004, Apr, 21(4), 661-70.
  50. Jung Y.D., Ellis L M . Inhibition of tumour invasion and angiogenesis by epigallocatechin gallate (EGCG), a major component of green tea. Int J Exp Pathol, 2001, Dec, 82(6), 309-16.
  51. Jung Y.D., Kim M.S., Shin B.A., Chay K.O., Ahn B.W., Liu W., Bucana CD., Gallick G.E., Ellis LM. EGCG, a major component of green tea, inhibits tumour growth by inhibiting VEGF induction in human colon carcinoma cells. Br J Cancer, 2001, Mar, 23, 84(6), 844-50.
  52. Katiyar S.K., Bergamo B.M., Vyalil P.K., Elmets C.A. Green tea polyphenols, DNA photodamage and photoimmunology. J Photochem PhotobiolB, 2001, Dec, 31, 65(2-3), 109-14.
  53. Katiyar S.K., Mukhtar H. Green tea polyphenol (-)-epigallocatechin3-gallate treatment to mouse skin prevents UVB-induced infiltration of leukocytes, depletion of antigen-presenting cells, and oxidative stress. J Leukoc Biol, 2001, May, 69(5), 719-26.
  54. Katiyar S.K. Skin photoprotection by green tea, antioxidant and immunomodulatory effects. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord, 2003, Sep, 3(3), 234-42.
  55. Kim J., Hwang J.S., Cho Y.K., Han Y., Jeon Y.J., Yang K.H. Protective effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on UVA-and UVB-induced skin damage. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol, 2001, Jan-Feb, 14(1), 11-9.
  56. Kim M.H., Jung M A , Hwang Y.S., Jeong M., Kim S.M., Ahn S.J., Shin B.A., Ahn B.W., Jung YD. Regulation of urokinase plasminogen activator by epigallocatechin-3-gallate in human fibrosarcoma cells. Eur J Pharmacol, 2004, Mar 8, 487(1-3), 1-6.
  57. Lee I.J., Han F., Baek J., Hisatsune A., Kim K.C. Inhibition of MUC1 expression by indole-3-carbinol. Int J Cancer, 2004, May 10,109(6), 810-6.
  58. Legha S.S. Tamoxifen in the treatment of breast cancer. Ann Intern Med, 1988,109,219-228.
  59. Li H., Lindenmeyer F., Grenet C, Opolon P., Menashi S., Soria C, Yeh P., Perricaudet M., Lu H. AdTIMP-2 inhibits tumor growth, angiogenesis, and metastasis, and prolongs survival in mice. Hum Gene Ther, 2001, Mar 20,12(5), 515-26.
  60. Liang Y.C., Huang Y., Tsai S., Lin-Shiau S., Chen C, Lin J. Suppression of inducible cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages. Carcinogenesis, 1999a, 20, 1945-1952.
  61. Liang Y.C., Lin-Shiau S.Y., Chen C.F., Lin J.K. Inhibition of cyclin-dependent kinases 2 and 4 activities as well as induction of Cdk inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast carcinoma cells by epigallocatechin-3-gallate. J Cell Biochem, 1999b, 75,1-12.
  62. Lin J., Zhang S.M., Cook N.R., Rexrode K.M., Lee I.M., Buring J.E. Body mass index and risk of colorectal cancer in women (United States). Cancer Causes Control, 2004, Aug, 15(6), 581-9.
  63. Lord R.S., Bongiovanni В., Bralley J.A. Estrogen metabolism and the diet-cancer connection, rationale for assessing the ratio of urinary hydroxylated estrogen metabolites. Altern Med Rev, 2002 Apr, 7(2), 112-29.
  64. Maeda-Yamamoto M., Kawahara H., Tahara N., Tsuju K., Hara Y., Isemura M. Effects of tea polyphenols on the invasion and matrix metalloproteinases activities of human fibrosarcoma HT1080 cells. J Agric Food Chem, 1999,47,2350-2354.
  65. Makimura M., Hirasawa M., Kobayashi K., Indo J., Sakanaka S., Taguchi Т., Otake S. Inhibitory effect of tea catechins on collagenase activity. J Periodontal, 1993, Jul, 64(7), 630-6.
  66. Mandel S., Weinreb O., Amit Т., Youdim M.B. Cell signaling pathways in the neuroprotective actions of the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate, implications for neurodegenerative diseases. J Neurochem, 2004, Mar, 88(6), 1555-69.
  67. Martinez-Arribas F., Nunez-Villar M.J., Lucas A.R., Sanchez J., Tejerina A., Schneider J. Immunofluorometric study of Bcl-2 and Bax expression in clinical fresh tumor samples from breast cancer patients. Anticancer Res, 2003, Jan-Feb, 23(1 B), 565-8.
  68. Mittal A., Piyathilake C, Hara Y., Katiyar S.K. Exceptionally high protection of photocarcinogenesis by topical application of (-)-epigallocatechin3-gallate in hydrophilic cream in SKH-1 hairless mouse model, relationship to inhibition of UVB-induced global DNA hypomethylation. Neoplasia, 2003, 5, 6, 555-65.
  69. Mutoh M., Takahashi M., Fukuda K., Matsushima-Hibiya Y., Mutoh H., Sugimura Т., Wakabayashi K. Suppression of cyclooxygenase-2 promoter-dependent transcriptional activity in colon cancer cells by chemopreventive agents with a resorcin-type structure. Carcinogenesis, 2000, 21, 959-963.
  70. Nair P., Nair K.M., Jayaprakash P.G., Pillai M.R. Decreased programmed cell death in the uterine cervix associated with high risk human papillomavirus infection. Pathol Oncol Res, 1999, 5, 2, 95-103.
  71. Nakagawa Т., Yokozawa Т., Sano M., Takeuchi S., Kim M., Minamoto S. Activity of (-)-Epigallocatechin 3-O-Gallate against Oxidative Stress in Rats with Adenine-lnduced Renal Failure. J Agric Food Chem, 2004, Apr 7, 52(7), 2103-2107.
  72. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E.B., Hilsenbeck S.G., McCue B.L., Wakeling A.E., McClelland R.A., Manning D.L, Nicholson R.I. Comparison of the effects of a pure steroidal antiestrogen with those of tamoxifen in a model of human breast cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, May 17, 87(10), 746-50.
  73. Park J.W, Choi Y.J., Suh S.I., Kwon Т.К. Involvement of ERK and protein tyrosine phosphatase signaling pathways in EGCG-induced cyclooxygenase-2 expression in Raw 264.7 cell. Biochem Biophys Res Commun, 2001,286,721-725.
  74. Parkin D.R., Malejka-Giganti D. Differences in the hepatic P450-dependent metabolism of estrogen and tamoxifen in response to treatment of rats with 3,3'-diindolylmethane and its parent compound indole-3-carbinol. Cancer Detect Prev, 2004, 28(1), 72-9.
  75. Peitsaro P., Ruutu M., Syrjanen S., Johansson B. Divergent expression changes of telomerase and E6/E7 mRNA, following integration of human papillomavirus type 33 in cultured epithelial cells. Scand J Infect Dis, 2004, 36(4), 302-4.
  76. Plug-DeMaggio A.W., Sundsvold Т., Wurscher M.A, Koop J.I., Klingelhutz A.J., McDougall J.K. Telomere erosion and chromosomal instability in cells expressing the HPV oncogene 16E6. Oncogene, 2004, Apr 29, 23(20), 3561-71.
  77. Porter W., Wang F., Duan R., Qin C, Castro-Rivera E., Safe S. Transcriptional activation of heat shock protein 27 gene expression by 17bestradiol and modulation by antiestrogens and aryl hydrocarbon receptor agonists, estrogenic activity of IC1164,384. J Mol Endocrinol, 2000, 26, 31-42.
  78. Rahman K.M., Aranha O., Sarkar F.H. lndole-3-carbinol (I3C) induces apoptosis in tumorigenic but not in nontumorigenic breast epithelial cells. Nutr Cancer, 2003, 45, 1,101-112.
  79. Ramirez-Mares M.V., de Mejia E.G. Comparative study of the antioxidant effect of ardisin and epigallocatechin gallate in rat hepatocytes exposed to benomyl and 1-nitropyrene. Food Chem Toxicol, 2003, Nov, 41(11), 1527-35.
  80. Ramondetta L.M., Palazzo J.P., Dunton C.J., Kovatich A.J., Carlson J.A. A comparative analysis of Ki-67, p53, and p21 WAF1CIP1 expression in tamoxifen associated endometrial carcinomas. Anticancer Res, 1998, Nov-Dec, 18(6B), 4661-5.
  81. Riethdorf L, Riethdorf S., Petersen S., Bauer M., Herbst H., Janicke F., Loning T. Urokinase gene expression indicates early invasive growth in squamous cell lesions of the uterine cervix. J Pathol, 1999, Oct, 189(2), 245-50.
  82. Sakanaka S., Okada Y. Inhibitory effects of green tea polyphenols on the production of a virulence factor of the periodontal-disease-causing anaerobic bacterium Porphyromonas gingivalis. J Agric Food Chem, 2004, 52(6), 1688-92.
  83. Sakata R., Ueno Т., Nakamura Т., Sakamoto M., Torimura Т., Sata
    M. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate inhibits platelet-derived growth factor-induced proliferation of human hepatic stellate cell line LI90. J Hepatol, 2004, Jan, 40(1), 52-9.
  84. Sarkar F.H., Rahman K.M., Li Y. Bax translocation to mitochondria is an important event in inducing apoptotic cell death by indole-3-carbinol (I3C) treatment of breast cancer cells. J Nutr, 2003,133, 7, 2434-2439.
  85. Sayama K., Lin S., Zheng G., Oguni I. Effects of green tea on growth, food utilization and lipid metabolism in mice. In Vivo, 2000, Jul-Aug, 14(4), 481-4.
  86. Shaheen R.M., Davis D.W., Liu W, Zebrowski B.K., Wilson M.R., Bucana CD., McConkey D.J., McMahon G., Ellis LM. Antiangiogenic therapy targeting the tyrosine kinase receptor for vascular endothelial growth factor receptor inhibits the growth of colon cancer liver metastasis and induces tumor and endothelial cell apoptosis. Cancer Res, 1999, Nov 1, 59(21), 5412-6.
  87. Singh A.K, Seth P., Anthony P., Husain M.M., Madhavan S., Mukhtar H, Maheshwari R.K. Green tea constituent epigallocatechin-3-gallate inhibits angiogenic differentiation of human endothelial cells. Arch Biochem Biophys, 2002, May 1, 401(1), 29-37.
  88. Stanley M. Chapter 17, Genital human papillomavirus infections-current and prospective therapies. J Natl Cancer Inst Monogr, 2003, 31,117-24.
  89. Taioli E., Garte S.J., Trachman J., Garbers S., Sepkovic D.W., Os-borne M.P., Mehl S., Bradlow H I . Ethnic differences in estrogen metabolism in healthy women. J Natl Cancer Inst, 1996, May 1, 88(9), 617.
  90. Talvensaari A., Apaja-Sarkkinen M., Hoyhtya M., Westerlund A., Puistola U., Turpeenniemi Т. Matrix metalloproteinase 2 immunoreactive protein appears early in cervical epithelial dedifferentiation. Gynecol Oncol, 1999, Mar, 72(3), 306-11.
  91. Tang F.Y., Nguyen N., Meydani M. Green tea catechins inhibit VEGF-induced angiogenesis in vitro through suppression of VE-cadherin phosphorylation and inactivation of Akt molecule. Int J Cancer, 2003, Oct 10, 106(6), 871-8.
  92. Tarani A., Negri E., LaVecchia C. Food and nutrient intake and risk of cataract. Ann Epidemiol, 1996, 6, 41-46.
  93. Toussaint-Smith E., Donner D.B., Roman A. Expression of human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncoproteins in primary foreskin keratinocytes is sufficient to alter the expression of angiogenic factors. Oncogene, 2004, Apr 15, 23(17), 2988-95.
  94. Turner M.A., Palefsky J.M. Urokinase plasminogen activator expression by primary and HPV 16-transformed keratinocytes. Clin Exp Metastasis, 1995, Jul, 13(4), 260-8.
  95. Vayalil P.K., Elmets С A., Katiyar S.K. Treatment of green tea polyphenols in hydrophilic cream prevents UVB-induced oxidation of lipids and proteins, depletion of antioxidant enzymes and phosphorylation of МАРК proteins in SKH-1 hairless mouse skin. Carcinogenesis, 2003, May, 24(5), 927-36.
  96. Vayalil P.K., Katiyar S.K. Treatment of epigallocatechin-3-gallate inhibits matrix metalloproteinases-2 and -9 via inhibition of activation of mitogen-activated protein kinases, c-jun and NF-kappaB in human prostate carcinoma DU-145 cells. Prostate, 2004, Apr 1, 59(1), 33-42.
  97. Vitaglione P., Fogliano V. Use of antioxidants to minimize the human health risk associated to mutagenic/carcinogenic heterocyclic amines in food. J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci, 2004, Mar 25,802(1), 189-99.
  98. Wei Y.H., Lee H.C. Oxidative stress, mitochondrial DNA mutation, and impairment of antioxidant enzymes in aging. Exp Biol Med (Maywood), 2002, Oct, 227(9), 671-82.
  99. Wheeler D.S., Catravas J.D., Odoms K., Denenberg A., Malhotra V., Wong H.R. Epigallocatechin-3-gallate, a green tea-derived polyphenol, inhibits IL-1 beta-dependent proinflammatory signal transduction in cultured respiratory epithelial cells. J Nutr, 2004, May, 134(5), 1039-44.
  100. Wilkinson M.G., Millar J.B.A. Control of the eukaryotic cell cycle by MAP kinase signaling pathways. FASEB J, 2000,14, 2147-2157.
  101. Yamaguchi M., Jie Z. Effect of polyphenols on calcium content and alkaline phosphatase activity in rat femoral tissues in vitro. Biol Pharm Bull, 2001, Dec, 24(12), 1437-9.
  102. Yang C.S., Landau J.M. Effects of tea consumption on nutrition and health. J Nutr, 2000, Oct, 130(10), 2409-12.
  103. Yokoyama M., Noguchi M., Nakao Y., Pater A., Iwasaka T. The tea polyphenol, (-)-epigallocatechin gallate effects on growth, apoptosis, and telomerase activity in cervical cell lines. Gynecol Oncol, 2004, Jan, 92(1), 197-204.
  104. Young H.S., Summers A.M., Bhushan M., Brenchley P.E., Griffiths C.E. Single-nucleotide polymorphisms of vascular endothelial growth factor in psoriasis of early onset. J Invest Dermatol, 2004, Jan, 122(1), 209-15.
  105. Zheng G., Sayama K., Okubo Т., Juneja L.R., Oguni I. Anti-obesity effects of three major components of green tea, catechins, caffeine and theanine, in mice. In Vivo, 2004, Jan-Feb, 18(1), 55-62.
  106. Zheng Y, Song H.J, Kim C.H., Kim H.S, Kim E.G., Sachinidis A, Ahn H.Y. Inhibitory effect of epigallocatechin 3-O-gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin II. J Cardiovasc Pharmacol, 2004, Feb 43(2), 200-8.

 

Содержание

Ольга ...

интересно и грамотно описано.

леокадия ...

спасибо за полезную информацию о том ,как важно и необходимо пить зеленый чай и есть много капусты для предупреждения развития раковых клеток

леокадия ...

спасибо за полезную информацию

Ваш вопрос, раздел: ОБОСНОВАННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ РАКА РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ :

Ваше имя:
Вопрос: Разрешено использование тэгов:
<b>жирный текст</b>
<i>курсив</i>
<a href="http://site.ru">ссылка</a>
  Copyright 2010