ПЦР-тест помогает определить распространенные типы ВПЧ в тканях гениталий и ротовой полости
ИМЯ: Дженнифер Вебстер-Сириак (Jennifer Webster-Cyriaque)
ДОЛЖНОСТЬ: Адъюнкт-профессор экологии полости рта, Колледж стоматологии, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл.
БИОГРАФИЯ: Доктор наук в микробиологии и иммунологии, закончила резидентуру по терапии в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл; начальник зубоврачебной службы в Государственном Университете Нью-Йорка (State University of New York).
Ученые колледжа при Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл разработали новую методику анализа на ВПЧ. Методика основана на вложенной количественной ПЦР и позволяет выявить четыре наиболее распространенных типа ВПЧ в частности и любые его штаммы в целом в тканях гениталий и ротовой полости.
В статье, опубликованной в прошлом месяце Virology Journal, ученые сообщают, что анализ основывается на отслеживании последовательностей гена в регионах ВПЧ 6, 11, 16, 18, а также высококонсервативной последовательность региона Е1. Клинические испытания показали, что эта методика способна выявить 35 штаммов ВПЧ высокого и низкого онкогенного риска в доброкачественных и злокачественных образцах тканей аногенитальной области, ротовой полости и поверхности кожи.
На материале образцов опухолей из аногенитальной области и ротовой полости новая методика анализа была сравнена со стандартным ПЦР-анализом, в котором применяются консенсусные праймеры. По словам ученых, было установлено, что общая чувствительность нового теста – 89%, а специфичность – 90%.
В настоящее время анализ состоит из двух отдельных ПЦР. Возможно, в будущем они будут совмещены в однопробирочный ПЦР-анализ, который позволит получить новые сведения о взаимосвязи различных типов ВПЧ и связанных с ними заболеваний. Речь идет не только о раке шейки матки, но и о раке головы и шеи, а также о папилломах в генитальной и ротовой области.
Группа исследователей также рассматривает потенциальные преимущества выпуска теста на рынок.
Ответственный автор Дженнифер Вебстер-Сириак, специалист в стоматологии, микробиологии и иммунологии, рассказала журналисту PCR Insider о разработке теста. Ниже приводится сокращенная версия их беседы.
Что побудило Вас начать эти исследования и разработать тест?
Мы проводим ряд клинических исследований для исследовательского альянса по оральному ВИЧ/СПИД, который является частью Группы клинических испытаний по СПИД. Оральный компонент был привнесен лишь несколько лет назад. И среди запланированных нами научных разработок в этой области было дать характеристику вызванным ВПЧ инфекциям ротовой полости и составить понятие о естественной истории заболеваний и возможностях лечения на местном и системном уровнях.
Это стало настоящим стимулом для нас, поскольку в последнее время значительно вырос уровень вызываемых ВПЧ заболеваний ротовой полости. После создания высокоактивных антиретровирусных препаратов для лечения и профилактики ВИЧ резко выросло количество случаев папиллом ротовой полости. А сейчас наблюдается все больше случаев вызванного ВПЧ рака головы и шеи.
Почему Вы разработали методику, которая позволяет выявлять как онкогенные, так и вызывающие папилломы типы ВПЧ?
Мы много работаем с ротовой жидкостью. Наблюдаемые в ней типы ВПЧ отличаются о тех, которые выявляют другие методики анализа. Существующие тесты направлены прежде всего на обнаружение специфичных для аногенитальной области штаммов.
Мы выбрали два наиболее распространенных онкогенных штамма – 16 и 18, и два наиболее распространенных штамма низкого риска – 6 и 11. Затем мы провели анализ на основе E1с использованием "вырожденных" праймеров, который позволяет выявить любые штаммы ВПЧ. Таким образом, при анализе различных биологических образцов мы ничего не упустим.
Поэтому Вам было так важно создать тест, который мог бы отличать онкогенные штаммы ВПЧ от других, не вызывающих рак шейки матки и прочие типы рака?
Да, а также определять локализацию штамма, то есть учитывать разницу между штаммами ВПЧ аногенитальной области и ротовой полости. К примеру, в нашей когорте встречались пары, которые приходили через год друг после друга с абсолютно одинаковыми штаммами ВПЧ. То есть, эти штаммы могут передаваться орально или половым путем.
В научной литературе, особенно по вопросам эпидемиологии, есть множество свидетельств тому, что у практикующих оральный секс людей гораздо чаще встречаются папилломы и рак ротовой полости. Возможно, эти заболевания связаны с ВПЧ. С появлением теста мы наконец можем разрешить все эти вопросы, уже не на эпидемиологическом уровне, а на молекулярном… точно узнать, что там происходит.
А прочие существующие молекулярные тесты на ВПЧ выявляют лишь те штаммы, которые чаще всего становятся причиной аногенитальных опухолей?
Именно так, эти тесты работают прежде всего с аногенитальными штаммами высокого онкогенного риска. Но за папилломы отвечают совсем другие штаммы, поэтому мы включили в нашу методику анализ на основе E1.
Вы выбрали те же четыре штамма, которые представлены и в препарате Гардасил компании Merck.
Эти четыре типа вируса наиболее часто становятся причиной связанных с ВПЧ заболеваний, как злокачественных, так и доброкачественных. Кроме того, в настоящий момент мы проводим клинические испытания, чтобы оценить эффективность этой вакцины и выяснить, каким образом она влияет на выделение орального ВПЧ. Сейчас у нас проходят два исследования, одно для мужчин, а второе - для женщин.
Какие зонды и методики Вы использовали при разработке теста?
Первый тест – на основе красителя SYBR Green, для E1. Второй – на основе специфичных проб TaqMan, выявляющих каждый из четырех указанных штаммов вируса.
Достаточно ли высоки показатели чувствительности и специфичности Вашего теста? Могли бы Вы как-то еще их улучшить?
Один из соавторов исследования – Джоел Палефски (Joel Palefsky) из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Мы отправили друг другу слепые образцы. Он предварительно протестировал свои образцы, кажется, посредством вырожденной ПЦР и гибридизации. Результаты нашего анализа на 100% совпали с его результатами. Так что я убедилась в надежности нашего теста.
Ваша методика анализа предназначается прежде всего для использования в ходе исследований. Как Вы думаете, окажется ли она полезна в диагностике?
Я думаю, да. Это одна из причин, по которой мы решили использовать количественную ПЦР. Данная технология широко применяется во многих лабораториях. Мы знаем, что во многих случаях до начала развития болезни наблюдается увеличение вирусной нагрузки. А поскольку тест количественный, то есть не дает лишь положительный и отрицательный результата, как многие другие, по нему мы можем судить об эффективности лечения или, в долгосрочной перспективе, оценить, насколько высок риск развития болезни. Я думаю, что количественная природа теста придает ему особую ценность.
Какова дальнейшая судьба Вашего исследования?
Его результаты уже широко применяются в различных клинических испытаниях. Кроме того, мы сейчас трудимся для объединения двух составляющих нашей методики анализа в один тест.
То есть, вы хотите создать однопробирочный тест? С какими трудностями Вы здесь столкнулись?
Основная проблема – это температура плавления. Мы сейчас выясняем, можем ли мы оптимизировать этот показатель. У нас все очень хорошо получилось с тестом на 4 типа ВПЧ. Сейчас мы работаем над оптимизацией теста по E1. Мы разрабатываем зонд, способный функционировать при оптимальной температуре.
Каковы рыночные перспективы Вашей методики? Работаете ли Вы в этом направлении?
Я надеюсь, что тест найдет свою нишу на рынке. По моему мнению, преимущества теста очевидны, ведь он способен выявлять различные типы ВПЧ и давать их количественную характеристику. Мы уже связались с университетским отделом по передаче технологий. Теперь нужно обратить к компаниям, выяснить степень их заинтересованности.
Кроме того, на основе этого теста мы хотим разработать особый тест для оральных штаммов ВПЧ. В его основу мы планируем положить ту же модель, и тест будет учитывать все наиболее часто выявляемые в ротовой полости штаммы ВПЧ. Таким образом, он станет инструментом для диагностики связанных с ВПЧ типов рака головы и шеи, а также папиллом ротовой полости.