ПЦР – полимеразная цепная реакция
В 1985 г. К. Мюллисом была разработана методика, названная впоследствии полимеразной цепной реакцией (ПЦР), речь шла о in vitro клонировании последовательностей ДНК. Суть метода в том, что анализируемый образец ДНК присоединяют к 2 синтетическим олигонуклеотидам – праймерам, размер которых составляет, примерно, 20 нуклеотидов. Каждый из олигонуклеотидов является комплементарным одному из 2-х концов отрезка ДНК.
Рис. 1. Полимеразная цепная реакция
Вследствие нагревания ДНК цепи двойной спирали разъединяются, а результатом последующего охлаждения является процесс гибридизации комплементарных участков фрагментов ДНК с праймерами. В конечном итоге получают раствор с однонитевыми ДНК, обладающими так называемыми затравками (праймерами), другими словами: короткими двухцепочечными фрагментами. После добавления ДНК-полимеразы и нуклеотидов происходит синтез комплементарных цепей и образование идентичных фрагментов ДНК.
Охлаждаясь, находящиеся в излишке праймеры гибридизируются повторно, причем, как с цепями исходных ДНК, так и с синтезированными. Внесенная в систему ДНК-полимераза способствует инициированию второго цикла полимеразной цепной реакции. Неоднократное повторение данной процедуры позволяет провести свыше 30 циклов удлинения праймеров ферментативным путем. Численность сегментов, ограниченных с двух концов праймерами ДНК, увеличивается, что можно отобразить зависимостью 2n, в которой n является числом циклов, то есть растет экспоненциально. Выход остальных продуктов реакции возрастает в линейной зависимости.
Как видим, в результате описываемой реакции происходит эффективное амплифицирование только ограниченных праймерами последовательностей ДНК. Первоначально для полимеразной цепной реакции пользовались фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. К недостаткам такого подхода относится то, что каждый новый цикл реакции начинается с пополнения реакционной смеси новой порцией фермента. К тому же, при соблюдении оптимальных температурных условий полимеразной цепной реакции, что составляет 37°С, наблюдается появление вторичных участков связывания праймеров, а так же амплификация незапланированных фрагментов генома, другими словами специфичность амплификации не является полной.
Существенного улучшения метода полимеразной цепной реакции достигают, заменяя фрагмент Кленова ДНК-полимеразой термофильной бактерии (Taq-полимеразой) Thermus aquaticus. Оптимальная температура ПЦР-реакции при управлении Taq-полимеразой – примерно 70°С. Второе важное свойство данной полимеразы, это ее неактивация после продолжительной инкубации в условиях температуры 95°С.
Применение Taq-полимеразы решает две проблемы сразу. Первое: поскольку термостабильная полимераза на стадии денатурации ДНК не инактивируется, отпадает необходимость добавлять фермент после каждого нового цикла реакции. Данное упрощение привело к автоматизации полимеразной цепной реакции, теперь лаборанту осталось лишь перемещать образцы в условия различных температур: 90-95°С (денатурация) и 60-70°С (ферментативная реакция и ренатурация ДНК).
Второе: условия высокого температурного оптимума катализируемой Taq-полимеразой реакции, позволили подобрать четкие температурные рамки отжига, что способствует гибридизации праймеров исключительно в заданной области изучаемых геномов. Данное обстоятельство существенно повысило чувствительность и специфичность метода.
Применение метода полимеразной цепной реакции позволяет проводить in vitro селективное обогащение препарата ДНК фрагментом с установленной последовательностью более чем в миллион раз. Благодаря методу стало возможным надежное выявление однокопийных генов и их вариантов в таких сложных и больших геномах, как геном человека.
Уровень чувствительности метода полимеразной цепной реакции таков, что амплифицирование в ПЦР и выявление целевой последовательности возможно даже в случае, когда ее выявляют один раз в образце, состоящем из 100 000 клеток.